Ces méthodes intègrent l’analyse d’imagerie par séquençage et cytométrie de flux de prochaine génération. Il peut aider à répondre à des questions intéressantes, comme si certaines altérations phénotypiques sont impliquant, au lieu du transcriptome, en particulier dans l’environnement d’exposition aux polluants. Le principal avantage de cette méthode simple pour nous est que nous pouvons l’utiliser pour mesurer la colocalisation de protéines biologiquement importantes, pour interpréter les résultats de l’expression différentielle clé des gènes à un niveau fonctionnel.
Les implications de cette technique s’étendent vers le diagnostic des résultats pathologiques et toxicologiques. Comme approche normale d’imageur, le forsee a la capacité de relier l’expression de gène à la fonction de protéine. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison des exigences techniques élevées de l’imagerie et de l’analyse transcriptomique.
Pour séquencer la bibliothèque de cellules dendritiques dérivée du monocyte humain, chargez d’abord les réapprovisionnements de séquençage et d’indexation sur la biosynthèse séquençante et l’indexation des supports de reagent, respectivement, et placez les supports dans un bain d’eau de qualité laboratoire pendant une heure, jusqu’à ce que toute la glace ait fondu, et que les reagents soient bien mélangés. Pendant que les reagents sont en dégel, la puissance sur le séquenceur, la connexion de l’ordinateur à un lecteur réseau lorsque le lecteur Ne pas éjecter apparaît, et le lancement du logiciel de contrôle séquenceur. Ensuite, ajoutez environ 100 millilitres de solution de lavage d’entretien à chacune des bouteilles dans la grille de réagenèse de biosynthèse de séquençage, et vissez un bouchon d’entonnoir sur chaque bouteille.
Ajouter environ 12 millilitres de solution de lavage d’entretien à chaque tube conique de 15 millilitres dans la grille de réaccage d’indexation et jeter les bouchons. Chargez ensuite les deux racks sur le séquenceur. Sélectionnez Maintenance Wash dans le logiciel de contrôle séquenceur et suivez les instructions pour nettoyer le système de fluide séquenceur.
Utilisez une lampe de poche pour inspecter visuellement la cellule d’écoulement pour les bulles qui traversent les voies, pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite. Lorsque la séquence de lavage est terminée, ouvrez l’onglet Séquence et démarrez une nouvelle course, en adlant les données de sortie vers un lecteur réseau. Téléchargez une feuille d’échantillon pour le démultiplexage et entrez les informations de réaccente appropriées.
Utilisez une cellule d’écoulement utilisée pour amorcer le système, avec les reagents de séquençage. Une fois la génération de cluster terminée, retirez la cellule d’écoulement. Et vaporiser légèrement la cellule avec de l’eau.
Essuyer la cellule d’écoulement à sec avec du papier de lentille, suivie d’un léger jet avec 95% d’éthanol. Après avoir essuyé à nouveau la cellule d’écoulement, vérifiez la surface de la cellule d’écoulement par rapport à la lumière pour vous assurer qu’elle est propre, sans débris ni résidus de sel. Lorsque l’étape principale est terminée, chargez la cellule d’écoulement groupée et commencez le séquençage.
Le logiciel de visionneuse d’analyse de séquence sera automatiquement démarré. Environ 26 heures plus tard, surveillez la qualité des données de séquençage via le logiciel de contrôle de séquence élevé, et visualisez le logiciel d’analyse de séquençage pour évaluer la qualité des données, et pour tout dépannage. Ensuite, lorsque la séquence est terminée, modifiez le joint de cellule d’écoulement et effectuez un lavage d’entretien avant de commencer la prochaine course.
Après l’imagerie cytométrique d’écoulement des cellules dendritiques polluantes exposées, ouvrez ImageJ Fiji, et fusionnez les 100 images cellulaires enregistrées pour les groupes d’échantillons de cellules dendritiques humains non exposés et exposés aux polluants en fichiers individuels selon le groupe de traitement. Pour analyser la colocalisation cd1d et Lamp1 au sein des deux populations, ouvrez l’image cellulaire fusionnée exposée aux polluants et sélectionnez image, couleur et canaux fractionnés pour diviser l’image en deux images individuelles avec un seul fluorophore par canal. Pour créer une parcelle de diffusion des pixels colocalisés, sélectionnez Analyser, Colocalisation et Seuil de colocalisation, et appuyez sur Imprimer l’écran pour enregistrer l’intrigue scatter.
Pour calculer le coefficient de colocalisation du Mander pour chaque image unicellulaire, utilisez l’outil de sélection ovale pour sélectionner une image à cellule unique dans le fichier d’image avec les canaux fractionnaux, et sélectionnez à nouveau Analyser, colocaliser et colocaliser le seuil. Sélectionnez ensuite Channel 1 dans la boîte de dialogue pour la région d’intérêt, et cliquez sur OK. Lorsque le coefficient a été calculé pour les 100 images cellulaires, importez les résultats dans une feuille de calcul appropriée et répétez l’analyse de l’échantillon de cellules non exposées de contrôle. À l’aide d’analyses de séquençage de l’ARN et de données transcriptomiques, plusieurs groupes génétiques modifiés majeurs, y compris le métabolisme lipidique et les fonctions endocytiques, ont été identifiés dans les CD exposés aux polluants.
Au niveau de l’image cellulaire individuelle, les cellules dendritiques positives HLADR CD11c peuvent être fermées, selon leur coexpression CD1d et Lamp1. Les cellules dendritiques non exposées de contrôle démontrent la colocalisation minimale des protéines CD1d et Lamp1, ce qui indique un niveau basal de trafic endocytique CD1d et un niveau élevé d’expression de surface dans des conditions physiologiques. Considérant que le CD1d est conservé dans les compartiments endocytiques tardifs des cellules dendritiques exposées aux polluants, confirmant les profils modifiés des gènes endocytiques dans cette population cellulaire expérimentale.
Après avoir fusionné les images cellulaires individuelles en un seul fichier d’image, les images individuelles peuvent être divisées en fonction de leur expression fluorophore, et la colocalisation de l’intensité des pixels entre les deux canaux peut être visualisée dans une intrigue de dispersion. Le degré de colocalisation entre les protéines CD1d et Lamp1 dans les deux groupes de traitement peut ensuite être quantifié à l’aide des coefficients de Mander. Si l’intensité protéique est hétérogène entre les zones colocalisées et non colocalisées, l’intensité colocalisée ne sera pas parallèle aux zones colocalisées, il est donc également important d’évaluer davantage la colocalisation des deux protéines, en fonction de l’intensité des pixels.
Une fois maîtrisée, l’analyse d’image peut être effectuée en deux heures, et la configuration de séquençage de l’ARN peut être effectuée en trois heures, si chaque technique est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que tous les reagents sont correctement chargés dans les positions correctes, et qu’il n’y a aucune fuite dans le séquenceur. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le micro ARN, l’exome ou le séquençage des mastocytes, peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur l’expression globale des micro ARN, la mutation génétique ou la méthylation de l’ADN, respectivement.
Ainsi, après son développement, cette technique aidera les chercheurs dans le domaine de l’analyse de l’imagerie cellulaire, et le séquençage de prochaine génération pour explorer l’effet du polluant environnemental sur l’expression des gènes et la fonction protéique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place le séquençage de prochaine génération, et l’analyse de l’imageur de la colocalisation des protéines. N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques polluants toxiques dans des échantillons de sang humain peut être extrêmement dangereux.
Des précautions telles que l’utilisation d’une hotte de fumée chimique et d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.
