L’objectif global de ce protocole est d’étudier le profil des anticorps anti-glycan circulants dans le sérum des petits animaux à l’aide d’une technologie imprimée à base de tableau glycan. Cette approche a un potentiel dans le diagnostic tôt et le bon traitement dans quelques conditions pathologiques où les anticorps contre des structures glycan jouent un rôle important. Le principal avantage de cette technique, est la possibilité de mesurer dans le même cadre expérimental des centaines de cibles glycan avec une sensibilité très élevée en utilisant une quantité minimale d’échantillon.
Pour préparer le micro-tableau, utilisez un tableau robotisé sans contact. Imprime six répliques de glycanes millimolaires et de 10 microgrammes par millilitre polysaccharides et 300 millimolaires PBS, pH 8,5 sur n-hydroxy 6 diapositives en verre dérivés cinnamiques. Chaque diapositive contient quatre blocs différents de sous-arras répétés six fois.
Chaque sous-array est formé par 112 taches glycanes différentes, y compris les contrôles. Incuber les glissières dans une boîte d’humidité à température ambiante pendant une heure. Pour bloquer les micro-tableaux, incuber les diapositives pendant 1 1/2 heure avec tampon bloquant à température ambiante.
Lavez ensuite la puce de glycol avec de l’eau ultra pure et séchez-la à l’air libre. Préparez tampon un par tampon quatre tel que décrit dans le protocole de texte. Pour préparer les copeaux et les échantillons de glycol, placez la boîte de rangement avec les glissières sur la table jusqu’à ce qu’elles atteignent la température ambiante.
Ouvrez la boîte et transférez la puce de glycol dans la chambre d’incubation qui devrait déjà être conditionnée avec du papier filtre humide pour maintenir l’humidité constante à l’intérieur de la chambre. Pendant ce temps, diluer le sérum souris avec tampon un dans des tubes de 1,5 millilitre. Homogénéiser la solution sérique pendant cinq secondes à l’aide d’un mélangeur vortex.
Après l’homogénéisation, incuber le sérum dilué à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain d’eau pour éviter l’agrégation d’immunoglobuline. Puis centrifuger les tubes pendant trois minutes à 10 000 fois G et 25 degrés Celsius. Recueillir le surnatant et jeter tout matériau précipité.
Placer soigneusement la puce de glycol dans la chambre d’incubation. Incubez-le avec un millilitre de tampon trois pour éliminer tout matériau résiduel à la surface de la puce glycol. Pendant 15 minutes, à 25 degrés Celsius.
Maintenez la puce de glycol dans une position verticale, et la lavée avec quelques gouttes de tampon trois à l’aide d’une pipette pasteur en plastique. Ensuite, retirez soigneusement le tampon de la surface de la puce glycol à l’aide de papier filtre. Remettre la puce de glycol dans la chambre d’incubation.
Étendre l’échantillon de sérum dilué sur la surface de la puce glycol à l’aide d’une micro pipette. Assurez-vous que toutes les zones sèches de la surface des copeaux de glycol sont couvertes par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la pointe de la pipette. Incuber avec agitation orbitale à 37 degrés Celsius pendant 1 1/2 heures.
Après l’incubation, retirer tout excès d’échantillon et plonger la puce de glycol pendant cinq minutes dans le tampon trois à 25 degrés Celsius. Passer la puce de glycol dans un récipient avec tampon quatre et enfin, laver la puce de glycol avec de l’eau ultra pure. Centrifuger la puce de glycol pendant une minute à 175 fois G et 25 degrés Celsius pour enlever le liquide.
Après avoir remis la puce de glycol dans la chambre d’incubation, étendre une solution d’anti-souris de chèvre conjuguée à la biotine sur la surface des copeaux de glycol. Incuber avec agitation orbitale à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez la fraction non lédée et répétez les étapes de lavage.
Après centrifugation, incuber la puce glycol dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 45 minutes avec deux microgrammes par millilitre de la solution de streptavidine étiquetée fluorochrome correspondante dans le tampon deux. Après avoir travaillé dans l’obscurité pour enlever la fraction non lié et répéter les étapes de lavage, sécher la puce de glycol par l’air. Pour numériser le tableau, laissez la puce glycol sur la table jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante dans l’obscurité.
En même temps, allumez le scanner de diapositives et le laser. En tenant le micro tableau, faites glisser la puce glycol dans la fente jusqu’à ce qu’elle touche le dos. Scannez la puce glycol en exécutant EasyScan et enregistrez l’analyse sous forme de fichier tif.
Quantifier le tableau à l’aide d’un système d’analyse ScanArray. Ouvrez les images précédemment numérisées en cliquant sur le fichier dans le configurer et le groupe de fichiers sur la fenêtre principale. Chargez le modèle de fichier de tableau correspondant au format GAL qui représente la disposition des glycanes imprimés sur la diapositive en verre.
Ajustez le modèle GAL en alignant soigneusement le tableau avec les taches de l’image et initiez la quantification. Sélectionnez les périmètres de quantification comme type de quantification exécuter facile quant et la méthode de quantification cercle fixe. Délectez toutes les options pour les taches de recherche automatique et sélectionnez lowess pour la méthode de normalisation.
Enregistrez les données quantifiées sous forme de fichier csv. Transférez ces données dans un fichier de feuille de calcul commun à l’aide de Microsoft Excel ou d’une autre application appropriée. Les souris génétiquement identiques ne devraient pas être considérées comme des équivalents immunologiques parce qu’elles ont développé différents modèles d’anticorps anti-glucides naturels.
Comme indiqué ici, seulement 12 spécificités glycan ont été conservées. Montré ici, est un exemple représentatif des images obtenues à partir de micro puces de numérisation à l’aide d’un scanner florescent. La grille est ensuite alignée sur les taches de chaque sous-tableau.
Le florescent est détecté pour chaque endroit et les résultats sont transférés dans un fichier de feuille de calcul commun. Après incubation avec le sérum de souris, les puces de glyco ont été scannées utilisant un lecteur de tableau de balayage. Les données ont été analysées avec un système d’analyse de micro-tableau et les résultats ont été exprimés dans RFU comme médiane plus de moins l’écart absolu médian.
Les couleurs bleues et blanches représentent des signaux de liaison de fond inférieurs à 4000 RFU. La couleur rouge représente des signaux de liaison positifs supérieurs ou égaux à 4000 RFU. La plupart des structures glycan exposées dans les puces de glycol n’ont pas été reconnues par le répertoire des anticorps anti-glycan circulants des souris de balp C.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en cinq heures et 45 minutes si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la technologie de tableau glycon imprimante pour étudier le répertoire et les niveaux d’anticorps anti-glucides circulants dans les échantillons de sérum. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la puce glyco doit être manipulée par une partie inférieure de la lumière des verres.
Où se trouve le code à barres. Afin d’éviter tout contact avec les glycanes imprimés. Assurez-vous également que toute la zone sèche de la puce glyco est couverte par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la pointe de la pipette.
Le volume nécessaire pour couvrir totalement une seule surface d’une puce glyco est d’environ un millilitre. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le tableau de suspension de base de microsphère peuvent être faites afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la détection multiplexe flexible du profil anticorps anti glycan. Après son introduction, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des molécules biomacrales et de l’immunologie pour explorer une interaction non protéique glycol chez l’ensemble des petits animaux.
