Общая цель этого протокола заключается в изучении профиля циркулирующих антигликан-антител в сыворотке крови мелких животных с использованием печатной технологии на основе гликанового массива. Этот подход имеет потенциал в ранней диагностике и правильное лечение в некоторых патологических условиях, где антитела против гликан структур играют важную роль. Основным преимуществом этого метода является возможность измерения в тех же экспериментальных условиях сотни гликан целей с очень высокой чувствительностью с использованием минимального количества образца.
Для подготовки микро массива используйте бесконтактный робот-массивер. Печатает шесть репликаций 50 миллимоляров гликанов и 10 микрограммов на миллилитр полисахаридов и 300 миллимоляров PBS, рН 8,5 на n-гидрокси 6 циннамических производных стеклянных слайдов. Каждый слайд содержит четыре различных блока субаррей, повторяющихся шесть раз.
Каждый subarray формируется 112 различных гликанов пятна, включая элементы управления. Инкубировать слайды в коробке с влагой при комнатной температуре в течение одного часа. Чтобы заблокировать микро массивы, инкубировать слайды в течение 1 1 / 2 часа с блокированием буфера при комнатной температуре.
Затем вымойте гликоль чип с ультра чистой водой и высушить его по воздуху. Подготовка буфера через буфер четыре, как описано в текстовом протоколе. Чтобы подготовить чипсы гликоля и образцы, положите ящик для хранения со слайдами на стол, пока они не достигнут комнатной температуры.
Откройте коробку и перенесите чип гликоля в инкубациольную камеру, которая уже должна быть обусловлена влажной фильтровальной бумагой, чтобы держать влажность постоянной внутри камеры. Между тем, разбавить сыворотку мышей с буфером один в 1,5 миллилитров труб. Гомогенизировать раствор сыворотки в течение пяти секунд с помощью вихревого миксера.
После гомогенизации инкубировать разбавленную сыворотку при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут на водяной бане, чтобы избежать агрегации иммуноглобулина. Затем центрифуга труб в течение трех минут при 10000 раз G и 25 градусов по Цельсию. Соберите супернатант и отбросьте любой осажденный материал.
Поместите чип гликоля тщательно в инкубационую камеру. Инкубировать его с одним миллилитров буфера три для устранения любого остаточного материала на поверхности чипа гликоля. В течение 15 минут, при 25 градусах по Цельсию.
Держите чип гликоля в вертикальном положении, и перемойте его с некоторыми каплями буфера три с помощью пластиковой пастер пипетки. Затем осторожно удалите буфер с поверхности чипа гликоля с помощью фильтровальной бумаги. Поместите чип гликоля обратно в инкубационую камеру.
Распространение разбавленного образца сыворотки по поверхности чипа гликола с помощью микро пипетки. Убедитесь, что все сухие участки поверхности чипа гликоля покрыты разбавленным образцом сыворотки с помощью кончика пипетки. Инкубация с орбитальным возбуждением при 37 градусах По Цельсию в течение 1 1/2 часов.
После инкубации удалите излишки образца и погрузите чип гликоля в течение пяти минут в буфер три при 25 градусах по Цельсию. Перенесите чип гликоля в контейнер с буфером четыре и, наконец, мыть чип гликоля с ультра чистой водой. Центрифуга гликоль чип в течение одной минуты при 175 раз G и 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить жидкость.
После размещения чипа гликоля обратно в инкубационо-инкубационую камеру, распространение раствор козы против мыши конъюгированных биотина над поверхностью чипа гликоля. Инкубировать с орбитальным возбуждением при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Удалите несвехую фракцию и повторите шаги стирки.
После центрифугирования инкубировать чип гликоля в темноте при 25 градусах по Цельсию в течение 45 минут с двумя микрограммами на миллилитр соответствующего фторхромного раствора стрептавидина в буфере два. После работы в темноте, чтобы удалить несвехую фракцию и повторяя шаги стирки, высушить чип гликоля по воздуху. Чтобы сканировать массив, оставьте чип гликоля на столе, пока он не достигнет комнатной температуры в темноте.
В то же время включите сканер слайдов и лазер. Удерживая микро массив, сдвиньте чип гликоля в слот, пока он не коснется спины. Сканирование чипа гликола с помощью EasyScan и сохранить сканирование в качестве файла tif.
Количественная оценка массива с помощью системы анализа ScanArray. Откройте ранее отсканированные изображения, нажав файл в группе настройки и файла на главном окне. Загрузите соответствующий шаблон файла массива в формате GAL, который представляет расположение печатных гликанов на стеклянном слайде.
Отрегулируйте шаблон GAL, тщательно согласовав массив с пятнами на изображении и инициировать количественную оценку. Выберите периметры количественной оценки, так как тип количественной оценки работает с простым квантовым и количественным методом фиксированного круга. Unclick все варианты для автоматического найти пятна и выбрать lowess для метода нормализации.
Сохраните количественные данные в качестве файла csv. Перенесите эти данные в общий файл электронной таблицы с помощью Microsoft Excel или другого соответствующего приложения. Генетически идентичных мышей не следует рассматривать как иммунологические эквиваленты, потому что они разработали различные модели естественных антиуглеводных антител.
Как показано здесь, только 12 гликан специфики были сохранены. Здесь показан репрезентативный пример изображений, полученных с помощью микротоков, сканирующих с помощью флуоресцентного сканера. Затем сетка выравнивается по пятнам в каждом под массиве.
Флоресента обнаруживается для каждого места и результаты передаются в общий файл электронной таблицы. После инкубации с помощью мышиной сыворотки чипы глико были отсканированы с помощью считыватель сканирующего массива. Данные анализировались с помощью системы микро массивного анализа, результаты были выражены в РФС как медианный плюс минус медианное абсолютное отклонение.
Синий и белый цвета представляют собой фоновые связывающие сигналы ниже 4000 РФС. Красный цвет представляет собой положительные связывающие сигналы больше или равны 4000 РФС. Большинство гликан структур подвергаются в гликоль чипы не были признаны в репертуаре циркулирующих антигликан антител мышей balp C.
После освоения этой техники можно сделать в течение пяти часов и 45 минут, если она выполнена должным образом. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать технологию массива принтера гликона для исследования репертуара и уровней циркулирующих антиуглеводных антител в образцах сыворотки. При попытке этой процедуры, важно помнить, что чип глико должны манипулировать нижней части стекла света.
Где находится штрих-код. Чтобы избежать контакта с напечатанными гликанами. Кроме того, убедитесь, что вся сухая область чипа глико покрыта разбавленным образцом сыворотки с помощью кончика пипетки.
Объем, необходимый для полностьюго покрытия одной поверхности чипа глико, составляет примерно один миллилитр. После этой процедуры, другие методы, такие как микросфера базы подвески массив может быть сделано для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с гибким мультиплекс обнаружения антигликан антител профиля. После его внедрения этот метод проложил путь для исследователей в области биоматериала молекул и иммунологии, чтобы исследовать небелковый гликоль взаимодействия в наборе мелких животных.
