Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das Profil zirkulierender antiglykanischer Antikörper im Serum von Kleintieren mit einer auf gedruckter Glykan-Array-basierten Technologie zu untersuchen. Dieser Ansatz hat ein Potenzial in der Frühdiagnose und die richtige Behandlung in einigen pathologischen Bedingungen, wo Antikörper gegen glykanische Strukturen eine wichtige Rolle spielen. Der Hauptvorteil bei dieser Technik ist die Möglichkeit, in der gleichen experimentellen Einstellung Hunderte von Glykan-Targets mit einer sehr hohen Empfindlichkeit mit einer minimalen Menge an Probe zu messen.
Verwenden Sie zum Vorbereiten des Micro-Arrays einen berührungslosen Roboter-Arrayer. Druckt sechs Replikationen von 50 Millimolaren Glykanen und 10 Mikrogramm pro Milliliter Polysaccharide und 300 Millimolar PBS, pH 8,5 auf n-Hydroxy 6 cinnamic derivatisierte Glasglyide. Jede Folie enthält vier verschiedene Blöcke von Unterarrays, die sechsmal wiederholt werden.
Jedes einzelne Subarray wird durch 112 verschiedene Glykanflecken einschließlich Kontrollen gebildet. Inkubieren Sie die Dias in einer Feuchtigkeitsbox bei Raumtemperatur für eine Stunde. Um die Mikro-Arrays zu blockieren, inkubieren Sie die Dias für 1 1/2 Stunden mit Sperrpuffer bei Raumtemperatur.
Dann waschen Sie den Glykol-Chip mit ultrareinem Wasser und trocknen Sie ihn an der Luft. Bereiten Sie Puffer eins durch Puffer vier vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Glykol-Chips und Proben vorzubereiten, legen Sie die Aufbewahrungsbox mit den Dias auf den Tisch, bis sie Raumtemperatur erreichen.
Öffnen Sie die Box und übertragen Sie den Glykolchip in die Inkubationskammer, die bereits mit Nassfilterpapier konditioniert werden sollte, um die Luftfeuchtigkeit in der Kammer konstant zu halten. In der Zwischenzeit das Mäuseserum mit Puffer eins in 1,5 Milliliter-Röhren verdünnen. Homogenisieren Sie die Serumlösung für fünf Sekunden mit einem Wirbelmischer.
Nach der Homogenisierung das verdünnte Serum bei 37 Grad Celsius 10 Minuten in einem Wasserbad inkubieren, um eine Immunglobulinaggregation zu vermeiden. Dann zentrifugieren Sie die Rohre für drei Minuten bei 10.000 mal G und 25 Grad Celsius. Sammle den Überstand und verwerfe jedes gefällte Material.
Legen Sie den Glykolchip vorsichtig in die Inkubationskammer. Inkubieren Sie es mit einem Milliliter Puffer drei, um Restmaterial auf der Oberfläche des Glykolchips zu eliminieren. Für 15 Minuten, bei 25 Grad Celsius.
Halten Sie den Glykol-Chip in einer vertikalen Position und waschen Sie ihn mit einigen Tropfen Puffer drei mit einer Kunststoff-Pasteurpipette. Entfernen Sie dann vorsichtig den Puffer von der Glykol-Chip-Oberfläche mit Filterpapier. Legen Sie den Glykolchip wieder in die Inkubationskammer.
Verteilen Sie die verdünnte Serumprobe mit einer Mikropipette über die Glykolchip-Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle trockenen Bereiche der Glykol-Chipoberfläche mit der Spitze der Pipette von der verdünnten Serumprobe abgedeckt werden. Inkubieren Sie mit Orbital-Agitation bei 37 Grad Celsius für 1 1/2 Stunden.
Nach der Inkubation entfernen Sie überschüssige Proben und tauchen Sie den Glykolchip für fünf Minuten in Puffer drei bei 25 Grad Celsius ein. Den Glykolchip in einen Behälter mit Puffer vier geben und schließlich den Glykolchip mit reinem Ultrawasser waschen. Zentrifuge den Glykol-Chip für eine Minute bei 175 mal G und 25 Grad Celsius, um die Flüssigkeit zu entfernen.
Nachdem Sie den Glykol-Chip wieder in die Inkubationskammer geben, eine Lösung der Zufeinerung der Ziege, die zu Biotin konjugiert ist, über die Glykolchip-Oberfläche verteilen. Inkubieren Sie mit Orbital-Agitation bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Entfernen Sie den ungebundenen Bruch, und wiederholen Sie die Waschschritte.
Nach zentrifugieren Sie den Glykolchip in der Dunkelheit bei 25 Grad Celsius für 45 Minuten mit zwei Mikrogramm pro Milliliter der entsprechenden fluorchromen-markierten Streptavidinlösung in Puffer zwei. Nach der Arbeit in der Dunkelheit, um die ungebundene Fraktion zu entfernen und die Waschschritte zu wiederholen, trocknen Sie den Glykol-Chip durch Luft. Um das Array zu scannen, lassen Sie den Glykolchip auf dem Tisch, bis er im Dunkeln Raumtemperatur erreicht.
Schalten Sie gleichzeitig den Diascanner und den Laser ein. Halten Sie das Mikro-Array, schieben Sie den Glykol-Chip in den Steckplatz, bis er den Rücken berührt. Scannen Sie den Glykol-Chip, indem Sie EasyScan ausführen, und speichern Sie den Scan als tif-Datei.
Quantifizieren Sie das Array mit einem ScanArray-Analysesystem. Öffnen Sie die zuvor gescannten Bilder, indem Sie im Hauptfenster auf Datei in der Konfigurations- und Dateigruppe klicken. Laden Sie die entsprechende Arraydateivorlage im GAL-Format, die die Disposition von gedruckten Glykanen auf dem Glasschlitten darstellt.
Passen Sie die GAL-Vorlage an, indem Sie das Array sorgfältig an den Punkten im Bild ausrichten und die Quantifizierung initiieren. Wählen Sie die Quantifizierungsperimeter als Quantifizierungstyp ausführen einfache Quantifizierung und Quantifizierung Sifikationsmethode festen Kreis. Klicken Sie auf alle Optionen für die auto find spots, und wählen Sie Lowess für die Normalisierungsmethode aus.
Speichern Sie die quantifizierten Daten als csv-Datei. Übertragen Sie diese Daten mithilfe von Microsoft Excel oder einer anderen geeigneten Anwendung in eine gemeinsame Tabellenkalkulationsdatei. Genetisch identische Mäuse sollten nicht als immunologische Äquivalente betrachtet werden, da sie unterschiedliche Muster natürlicher Anti-Kohlenhydrat-Antikörper entwickelt haben.
Wie hier gezeigt, wurden nur 12 Glyglyan-Spezifitäten konserviert. Hier ist ein repräsentatives Beispiel für die Bilder, die aus dem Scannen von Mikrochips mit einem Floreszenzscanner gewonnen wurden. Das Raster wird dann an den Spots in jedem einzelnen Sub-Array ausgerichtet.
Die Florescent werden für jeden Punkt erkannt und die Ergebnisse werden in eine gemeinsame Tabellenkalkulationsdatei übertragen. Nach der Inkubation mit Mausserum wurden die Glykochips mit einem Scan-Array-Reader gescannt. Die Daten wurden mit einem Mikro-Array-Analysesystem analysiert und die Ergebnisse wurden in RFU als Median plus minus der absoluten Mittelabweichung ausgedrückt.
Blaue und weiße Farben stellen Hintergrundbindungssignale von weniger als 4000 RFU dar. Rote Farbe steht für positive Bindungssignale größer oder gleich 4000 RFU. Die meisten der in den Glykol-Chips exponierten Glykinstrukturen wurden im Repertoire der zirkulierenden antiglygischen Antikörper von Balp-C-Mäusen nicht erkannt.
Einmal gemeistert kann diese Technik in fünf Stunden und 45 Minuten durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Technologie des Druckerglycon-Arrays verwenden können, um das Repertoire und den Gehalt an zirkulierenden Anti-Kohlenhydrat-Antikörpern in Serumproben zu untersuchen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Glykochip von einem unteren Teil der Brille Licht manipuliert werden muss.
Wo sich der Barcode befindet. Um den Kontakt mit den gedruckten Glykanen zu vermeiden. Stellen Sie außerdem sicher, dass der gesamte trockene Bereich des Glykochips mit der Spitze der Pipette durch die verdünnte Serumprobe abgedeckt wird.
Das Volumen, das benötigt wird, um eine einzelne Oberfläche eines Glykochips vollständig abzudecken, beträgt etwa einen Milliliter. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Microsphere Base Suspension Array durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit dem flexiblen Multiplex-Nachweis von Antiglykan-Antikörper-Profil zu beantworten. Nach ihrer Einführung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der biomakulralen Moleküle und Immunologie, um eine nicht proteinreiche Glykol-Wechselwirkung in der Gruppe von Kleintieren zu erforschen.
