L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare il profilo degli anticorpi anti-glicina circolanti nel siero di piccoli animali utilizzando una tecnologia basata su array di glicani stampati. Questo approccio ha un potenziale nella diagnosi precoce e nel giusto trattamento in alcune condizioni patologiche in cui gli anticorpi contro le strutture glicenali svolgono un ruolo importante. Il vantaggio principale con questa tecnica, è la possibilità di misurare nella stessa impostazione sperimentale centinaia di bersagli di glicina con una sensibilità molto elevata utilizzando una quantità minima di campione.
Per preparare il micro array, utilizzare un arrayer robotico senza contatto. Stampa sei repliche di glicani millimolari e 10 microgrammi per polisaccaridi millilitro e PBS da 300 millimolare, pH 8,5 su diapositive di vetro derivatizzato n-idrossi 6 cinnamici. Ogni diapositiva contiene quattro diversi blocchi di sottoarray ripetuti sei volte.
Ogni singolo sottomaschera è formato da 112 diverse macchie di glicani, inclusi i controlli. Incubare gli scivoli in una scatola di umidità a temperatura ambiente per un'ora. Per bloccare i micro array, incubare le diapositive per 1 ora e mezza con tampone di blocco a temperatura ambiente.
Quindi lavare il chip glicole con acqua ultra pura e asciugarlo per via aerea. Preparare il buffer da uno a buffer quattro come descritto nel protocollo di testo. Per preparare i trucioli e i campioni di glicole, mettere la scatola di stoccaggio con le diapositive sul tavolo fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Aprire la scatola e trasferire il chip glicole nella camera di incubazione che dovrebbe essere già condizionata con carta filtrante bagnata per mantenere costante l'umidità all'interno della camera. Nel frattempo, diluire il siero dei topi con tampone uno in 1,5 tubi millilitri. Omogeneizzare la soluzione siere per cinque secondi con un miscelatore a vortice.
Dopo l'omogeneizzazione, incubare il siero diluito a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno d'acqua per evitare l'aggregazione di immunoglobuline. Quindi centrifugare i tubi per tre minuti a 10.000 volte G e 25 gradi Celsius. Raccogliere il supernatante e scartare qualsiasi materiale precipitato.
Posizionare accuratamente il chip glicole nella camera di incubazione. Incubarlo con un millilitro di tampone tre per eliminare qualsiasi materiale residuo sulla superficie del chip glicole. Per 15 minuti, a 25 gradi Celsius.
Tenere il chip glicole in posizione verticale e lavarlo di nuovo con alcune gocce di tampone tre utilizzando una pipetta pasteur di plastica. Quindi, rimuovere con cura il tampone dalla superficie del chip glicole utilizzando carta da filtro. Riposizionare il chip glicole nella camera di incubazione.
Stendere il campione di siero diluito sulla superficie del chip glicole utilizzando una micro pipetta. Assicurarsi che tutte le aree secche della superficie del chip glicole siano coperte dal campione di siero diluito utilizzando la punta della pipetta. Incubare con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius per 1 ora e mezza.
Dopo l'incubazione, rimuovere qualsiasi campione in eccesso e immergere il chip glicole per cinque minuti nel tampone tre a 25 gradi Celsius. Passare il chip glicole a un contenitore con tampone quattro e, infine, lavare il chip glicole con acqua ultra pura. Centrifugare il chip glicole per un minuto a 175 volte G e 25 gradi Celsius per rimuovere il liquido.
Dopo aver riposizionare il chip glicole nella camera di incubazione, stendere una soluzione di capra anti-topo coniugata alla biotina sulla superficie del chip glicole. Incubare con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius per un'ora. Rimuovere la frazione non vincolata e ripetere i passaggi di lavaggio.
Dopo la centrifugazione, incubare il chip glicole nell'oscurità a 25 gradi Celsius per 45 minuti con due microgrammi per millilitro della corrispondente soluzione di streptavidina etichettata al fluorocromo nel tampone due. Dopo aver lavorato nell'oscurità per rimuovere la frazione non vincolata e ripetere i passaggi di lavaggio, asciugare il chip glicole per via aerea. Per scansionare l'array, lasciare il chip glicole sul tavolo fino a raggiungere la temperatura ambiente al buio.
Allo stesso tempo, accendere lo scanner di diapositive e il laser. Tenendo il micro array, far scorrere il chip glicole nello slot fino a toccarlo. Eseguire la scansione del chip glicole eseguendo EasyScan e salvare la scansione come file tif.
Quantificare la matrice utilizzando un sistema di analisi ScanArray. Aprire le immagini digitalizzate in precedenza facendo clic sul file nel gruppo configura e file nella finestra principale. Caricare il modello di file di matrice corrispondente in formato ELENCO che rappresenta la disposizione dei glicani stampati nella diapositiva di vetro.
Regolare il modello elenco indirizzi globale allineando accuratamente l'array ai punti dell'immagine e avviando la quantificazione. Selezionare i perimetri di quantificazione in quanto il tipo di quantificazione esegue un facile cerchio fisso del metodo di quantificazione e quantificazione. Deselezionare tutte le opzioni per individuare automaticamente i punti e selezionare lowess per il metodo di normalizzazione.
Salvare i dati quantificati come file CSV. Trasferire questi dati in un file di foglio di calcolo comune utilizzando Microsoft Excel o un'altra applicazione appropriata. I topi geneticamente identici non dovrebbero essere considerati equivalenti immunologici perché hanno sviluppato diversi modelli di anticorpi anti carboidrati naturali.
Come mostrato qui, solo 12 specificità glicane sono state conservate. Mostrato qui, è un esempio rappresentativo delle immagini ottenute dalla scansione di micro chip utilizzando uno scanner florescent. La griglia viene quindi allineata alle macchie in ogni singola sottomaschera.
I florescent vengono rilevati per ogni punto e i risultati vengono trasferiti in un file di foglio di calcolo comune. Dopo l'incubazione con siero di topo, i trucioli di glico sono stati scansionati utilizzando un lettore di array di scansione. I dati sono stati analizzati con un sistema di analisi di micro array e i risultati sono stati espressi in RFU come mediana più di meno la deviazione assoluta mediana.
I colori blu e bianco rappresentano segnali di legame di sfondo inferiori a 4000 RFU. Il colore rosso rappresenta segnali di legame positivi maggiori o uguali a 4000 RFU. La maggior parte delle strutture glicenali esposte nei trucioli di glicole non sono state riconosciute dal repertorio degli anticorpi anti glicici circolanti dei topi balp C.
Una volta padroneggiata questa tecnica può essere eseguita in cinque ore e 45 minuti se viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnologia printer glycon array per indagare il repertorio e i livelli di anticorpi anti carboidrati circolanti nei campioni di siero. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il chip glico deve essere manipolato da una parte inferiore della luce degli occhiali.
Dove si trova il codice a barre. In modo da evitare il contatto con i glicani stampati. Inoltre, assicurarsi che tutta l'area secca del chip glico sia coperta dal campione di siero diluito utilizzando la punta della pipetta.
Il volume necessario per coprire totalmente una singola superficie di un chip glico è di circa un millilitro. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'array di sospensioni di base della microsfera possono essere fatti al fine di rispondere ad altre domande relative al rilevamento multiplex flessibile del profilo degli anticorpi antiglici. Dopo la sua introduzione questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle molecole biomacrali e dell'immunologia per esplorare un'interazione di glicole non proteico nell'insieme dei piccoli animali.
