このプロトコルの全体的な目標は、印刷されたグリカンアレイベースの技術を用いて、小動物の血清中の循環抗グリカン抗体のプロファイルを研究することです。このアプローチは、早期診断と、グリカン構造に対する抗体が重要な役割を果たすいくつかの病理学的条件における適切な治療に可能性を有する。この技術を用いた主な利点は、最小量のサンプルを用いて非常に高感度の数百のグリカンターゲットを同じ実験設定で測定する可能性である。
マイクロアレイを準備するには、非接触ロボットアレイを使用します。50ミリモルグリカンと1ミリリットル多糖10マイクログラムの6つの複製と300ミリモルPBS、pH 8.5をn-ヒドロキシ6シナミック誘導体化ガラススライドに印刷します。各スライドには、6回繰り返される4つの異なるサブ配列ブロックが含まれています。
すべての単一のサブ配列は、コントロールを含む112の異なるグリカンスポットによって形成される。スライドを室温の湿気箱に1時間インキュベートします。マイクロアレイをブロックするには、室温でブロッキングバッファーを使用してスライドを1時間半インキュベートします。
その後、グリコールチップを超純水で洗い、空気で乾燥させます。テキスト プロトコルで説明されているように、バッファー 1 からバッファー 4 までを準備します。グリコールチップとサンプルを準備するには、スライドを付けて保管ボックスをテーブルの上に置き、室温に達します。
箱を開け、グリコールチップをインキュベーションチャンバーに移し、すでに湿式フィルターペーパーで調整して、室内の湿度を一定に保ちます。一方、1.5ミリリットルチューブに1つの緩衝液でマウス血清を希釈する。渦ミキサーで血清溶液を5秒間均質化します。
均質化後、免疫グロブリン凝集を避けるために、希釈した血清を水浴中で摂氏37度で10分間インキュベートします。その後、チューブを10,000倍Gと摂氏25度で3分間遠心分離します。上清を収集し、任意の沈殿物を捨てます。
グリコールチップをインキュベーションチャンバーに慎重に置きます。1ミリリットルのバッファー3でそれをインキュベートして、グリコールチップの表面上の残留材料を排除します。摂氏25度で15分間。
グリコールチップを垂直位置に保持し、プラスチック製のパスツールピペットを使用してバッファ3の滴で再洗浄します。次に、フィルターペーパーを用いてグリコールチップ表面から緩衝液を慎重に除去する。グリコールチップをインキュベーションチャンバーに戻します。
マイクロピペットを使用して、希釈した血清サンプルをグリコールチップ表面に広げます。グリコールチップ表面の乾燥した部分がピペットの先端を使用して希釈された血清サンプルで覆われていることを確認します。摂氏37度で1時間半の軌道攪拌でインキュベートする。
インキュベーションに続いて、余分なサンプルを取り除き、25°Cのバッファ3に5分間グリコールチップを浸します。グリコールチップをバッファー4の容器に渡し、最後にグリコールチップを超純水で洗浄します。グリコールチップを175倍Gで1分間、摂氏25度で遠心分離して液体を取り除きます。
グリコールチップをインキュベーションチャンバーに戻した後、グリコールチップ表面上にヤギ抗マウスコンジュゲートの溶液をビオチンに広げる。摂氏37度で1時間の軌道攪拌でインキュベートする。非結合分数を削除し、洗浄手順を繰り返します。
遠心分離後、グリコライクチップを摂氏25度で45分間、フルオロクロム標識ストレプトアビジン溶液のミリリットル当たり2マイクログラムで45分間インキュベートします。暗闇の中で非結合分を除去し、洗浄工程を繰り返した後、グリコールチップを空気で乾燥させます。アレイをスキャンするには、グリコールチップを暗い温度に達するまでテーブルの上に置いておきます。
同時に、スライドスキャナーとレーザーをオンにします。マイクロアレイを保持し、グリコールチップをスロットにスライドさせて背面に触れます。EasyScanを実行してグリコールチップをスキャンし、tifファイルとしてスキャンを保存します。
ScanArray 解析システムを使用して配列を定量化します。メイン ウィンドウの構成とファイル グループのファイルをクリックして、以前にスキャンしたイメージを開きます。ガラススライド上の印刷されたグリカンの性質を表すGAL形式で対応する配列ファイルテンプレートをロードします。
配列を画像内のスポットに慎重に合わせて調整し、定量を開始して、GAL テンプレートを調整します。定量タイプが簡単に定量化および定量方法固定円として定量化の周長を選択します。自動検索スポットのすべてのオプションをオフにし、正規化方法の安値を選択します。
定量化されたデータを csv ファイルとして保存します。Microsoft Excel または別の適切なアプリケーションを使用して、このデータを共通のスプレッドシート ファイルに転送します。遺伝的に同一のマウスは、天然の抗炭水化物抗体の異なるパターンを開発しているので、免疫学的同等物と考えるべきではありません。
ここに示すように、12個のグリカン特異性のみが保存された。ここに示す、フローレススキャナを用いたマイクロチップスキャンから得られる画像の代表的な例である。グリッドは、すべての単一のサブ配列のスポットに揃えられます。
フロレスはスポットごとに検出され、結果は共通のスプレッドシートファイルに転送されます。マウス血清によるインキュベーションに続いて、糖チップをスキャンアレイリーダーを用いてスキャンした。マイクロアレイ解析システムでデータを解析し、結果は中央値プラスから中央値の絶対偏差を引いたものとしてRFUで表した。
青と白の色は4000 RFUより低いの背景色の結合信号を表す。赤色は、4000 RFU以上の正の結合信号を表します。グリコールチップに露出したグリカン構造のほとんどは、balp Cマウスの循環抗グリカン抗体のレパートリーによって認識されなかった。
このテクニックを習得したら、5時間45分で実行すれば、適切に実行できます。このビデオを見た後、あなたはレパートリーと血清サンプル中の循環抗炭水化物抗体のレベルを調査するためにプリンタグリコールアレイ技術を使用する方法をよく理解している必要があります。この手順を試みる際には、グリコチップはメガネライトの底部で操作する必要があることを覚えておくことが重要です。
バーコードが配置されている場所。印刷されたグリカンとの接触を避けるように。また、グリコチップの乾燥領域はすべて、ピペットの先端を使用して希釈された血清サンプルで覆われていることを確認してください。
グリコチップの単一の表面を完全に覆うために必要な体積はおよそ1ミリリットルです。この手順に従って、マイクロスフィアベースサスペンションアレイのような他の方法は、抗グリカン抗体プロファイルの柔軟な多重検出に関連する追加の質問に答えるために行うことができます。導入後、この技術は、バイオマカラ分子と免疫学の分野の研究者が小動物のセット中の非タンパク質グリコール相互作用を探求する道を開いた。
