El objetivo general de este protocolo es estudiar el perfil de los anticuerpos antiríglicanos circulantes en el suero de animales pequeños utilizando una tecnología basada en matriz de glicanos impresos. Este enfoque tiene un potencial en el diagnóstico precoz y el tratamiento adecuado en algunas condiciones patológicas donde los anticuerpos contra las estructuras glicánicas juegan un papel importante. La principal ventaja de esta técnica, es la posibilidad de medir en el mismo entorno experimental cientos de objetivos de glicano con una sensibilidad muy alta utilizando una cantidad mínima de muestra.
Para preparar la micro matriz, utilice un arrayer robótico sin contacto. Imprime seis réplicas de 50 glicanos milimotores y 10 microgramos por mililitro polisacáridos y 300 PBS militrolares, pH 8.5 en n-hidroxi 6 portaobjetos de vidrio derivatizado cinnámico. Cada diapositiva contiene cuatro bloques diferentes de subarrays repetidos seis veces.
Cada subbarra está formada por 112 puntos de glicanos diferentes, incluidos los controles. Incubar los portaobjetos en una caja de humedad a temperatura ambiente durante una hora. Para bloquear las micro matrices, incubar los portaobjetos durante 1 1/2 horas con tampón de bloqueo a temperatura ambiente.
A continuación, lave el chip de glicol con agua ultra pura y séquelo por aire. Prepare el búfer uno a través del búfer cuatro como se describe en el protocolo de texto. Para preparar las virutas y muestras de glicol, coloque la caja de almacenamiento con los portaobjetos sobre la mesa hasta que alcancen la temperatura ambiente.
Abra la caja y transfiera el chip de glicol a la cámara de incubación que ya debe estar acondicionado con papel de filtro húmedo para mantener la humedad constante dentro de la cámara. Mientras tanto, diluir el suero de ratones con tampón uno en tubos de 1,5 mililitros. Homogeneizar la solución sérica durante cinco segundos con un mezclador de vórtice.
Después de la homogeneización, incubar el suero diluido a 37 grados centígrados durante 10 minutos en un baño de agua para evitar la agregación de inmunoglobulina. Luego centrifuga los tubos durante tres minutos a 10.000 veces G y 25 grados Celsius. Recoger el sobrenadante y desechar cualquier material precipitado.
Coloque el chip de glicol cuidadosamente en la cámara de incubación. Incubarlo con un mililitro de tampón tres para eliminar cualquier material residual en la superficie del chip de glicol. Durante 15 minutos, a 25 grados Centígrados.
Sostenga el chip de glicol en una posición vertical y vuelva a lavarlo con unas gotas de tampón tres utilizando una pipeta de plástico pasteur. A continuación, retire cuidadosamente el tampón de la superficie de la viruta de glicol utilizando papel de filtro. Vuelva a colocar el chip de glicol en la cámara de incubación.
Extienda la muestra de suero diluida sobre la superficie de la viruta de glicol utilizando una micro pipeta. Asegúrese de que todas las áreas secas de la superficie de la viruta de glicol estén cubiertas por la muestra de suero diluida utilizando la punta de la pipeta. Incubar con agitación orbital a 37 grados celsius durante 1 1/2 horas.
Después de la incubación, retire cualquier exceso de muestra y sumerja el chip de glicol durante cinco minutos en el tampón tres a 25 grados centígrados. Pasar el chip de glicol a un recipiente con tampón cuatro y, finalmente, lavar el chip de glicol con agua ultra pura. Centrifugar el chip de glicol durante un minuto a 175 veces G y 25 grados Celsius para eliminar el líquido.
Después de colocar el chip de glicol de nuevo en la cámara de incubación, esparcir una solución de cabra anti-ratón conjugado a biotina sobre la superficie de la viruta de glicol. Incubar con agitación orbital a 37 grados centígrados durante una hora. Retire la fracción sin enlazar y repita los pasos de lavado.
Después de la centrifugación, incubar el chip de glicol en la oscuridad a 25 grados Celsius durante 45 minutos con dos microgramos por mililitro de la correspondiente solución de estreptavidina etiquetada con fluorocromo en el buffer dos. Después de trabajar en la oscuridad para eliminar la fracción sin ataduras y repetir los pasos de lavado, seque el chip de glicol por aire. Para escanear la matriz, deje el chip de glicol sobre la mesa hasta que alcance la temperatura ambiente en la oscuridad.
Al mismo tiempo, encienda el escáner deslizante y el láser. Sosteniendo la micro matriz, deslice el chip de glicol en la ranura hasta que toque la parte posterior. Escanee el chip de glicol ejecutando EasyScan y guarde el escaneo como un archivo tif.
Cuantifique la matriz mediante un sistema de análisis ScanArray. Abra las imágenes escaneadas anteriormente haciendo clic en el archivo en el grupo de configuración y archivos de la ventana principal. Cargue la plantilla de archivo de matriz correspondiente en formato GAL que representa la disposición de los glicanos impresos en la diapositiva de vidrio.
Ajuste la plantilla GAL alineando cuidadosamente la matriz con los puntos de la imagen e inicie la cuantificación. Seleccione los perímetros de cuantificación como tipo de cuantificación ejecutar fácil cantidad y método de cuantificación círculo fijo. Haga clic en todas las opciones para los puntos de búsqueda automática y seleccione lowess para el método de normalización.
Guarde los datos cuantificados como un archivo csv. Transfiera estos datos a un archivo de hoja de cálculo común mediante Microsoft Excel u otra aplicación adecuada. Los ratones genéticamente idénticos no deben considerarse como equivalentes inmunológicos porque han desarrollado diferentes patrones de anticuerpos naturales anticartínitos.
Como se muestra aquí, sólo se conservaron 12 especificidades de glicanos. Aquí se muestra un ejemplo representativo de las imágenes obtenidas del escaneo de micro chips utilizando un escáner florescente. A continuación, la cuadrícula se alinea con los puntos de cada submatriz.
Los florescentes se detectan para cada punto y los resultados se transfieren a un archivo de hoja de cálculo común. Después de la incubación con suero de ratón, los chips de glico fueron escaneados usando un lector de matriz de escaneo. Los datos se analizaron con un sistema de análisis de micro array y los resultados se expresaron en RFU como mediana más de menos la mediana de desviación absoluta.
Los colores azul y blanco representan señales de encuadernación de fondo inferiores a 4000 RFU. El color rojo representa señales de unión positivas mayores o iguales a 4000 RFU. La mayoría de las estructuras de glicano expuestas en los chips de glicol no fueron reconocidas por el repertorio de anticuerpos antiglicanos circulantes de ratones de balp C.
Una vez dominada esta técnica se puede hacer en cinco horas y 45 minutos si se realiza correctamente. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar la tecnología de matriz de glución de la impresora para investigar el repertorio y los niveles de anticuerpos antihidratos de carbono circulantes en las muestras de suero. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el chip de glico debe ser manipulado por una parte inferior de la luz de las gafas.
Dónde se encuentra el código de barras. Para evitar el contacto con los glicanos impresos. Además, asegúrese de que toda el área seca del chip de glico esté cubierta por la muestra de suero diluida utilizando la punta de la pipeta.
El volumen necesario para cubrir totalmente una sola superficie de una viruta de glico es de aproximadamente un mililitro. Siguiendo este procedimiento, se pueden hacer otros métodos como la matriz de suspensión de la base de microesfera para responder preguntas adicionales relacionadas con la detección de multiplexor flexible del perfil de anticuerpos antigán. Después de su introducción, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las moléculas biomacral y la inmunología exploraran una interacción no proteica de glicol en el conjunto de animales pequeños.
