O objetivo geral deste protocolo é estudar o perfil dos anticorpos antiglicanos circulantes no soro de pequenos animais usando uma tecnologia baseada em matriz glicano impresso. Essa abordagem tem potencial no diagnóstico precoce e no tratamento correto em algumas condições patológicas onde os anticorpos contra estruturas glican desempenham um papel importante. A principal vantagem com essa técnica é a possibilidade de medir no mesmo cenário experimental centenas de alvos glicanos com uma sensibilidade muito alta usando uma quantidade mínima de amostra.
Para preparar a micro matriz, use um arrayer robótico sem contato. Imprime seis réplicas de 50 glicanos milimolares e 10 microgramas por polissacarídeos mililitros e 300 mililitros PBS, pH 8,5 em n-hidroxy 6 lâminas de vidro derivatizadas cinnâmicas. Cada slide contém quatro blocos diferentes de subarrays repetidos seis vezes.
Cada subarray é formada por 112 pontos diferentes de glicanos, incluindo controles. Incubar os slides em uma caixa de umidade em temperatura ambiente por uma hora. Para bloquear as micro matrizes, incubar os slides por 1 1/2 horas com tampão de bloqueio à temperatura ambiente.
Em seguida, lave o chip glicol com água ultra pura e seque-o pelo ar. Prepare o buffer um através do buffer quatro, conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar os chips e amostras de glicol, coloque a caixa de armazenamento com os slides sobre a mesa até atingirem a temperatura ambiente.
Abra a caixa e transfira o chip glicol para a câmara de incubação que já deve ser condicionado com papel filtro molhado para manter a umidade constante dentro da câmara. Enquanto isso, diluir o soro de camundongos com tampão um em tubos de 1,5 mililitro. Homogeneize a solução de soro por cinco segundos com um misturador de vórtice.
Após a homogeneização, incubar o soro diluído a 37 graus celsius por 10 minutos em um banho de água para evitar a agregação de imunoglobulina. Em seguida, centrifugar os tubos por três minutos a 10.000 vezes G e 25 graus Celsius. Recolhe o supernaspe e descarta qualquer material precipitado.
Coloque o chip glicol cuidadosamente na câmara de incubação. Incuba-o com um mililitro de tampão três para eliminar qualquer material residual na superfície do chip glicol. Por 15 minutos, a 25 graus Celsius.
Segure o chip glicol em uma posição vertical e recue-o com algumas gotas de buffer três usando uma pipeta pasteur de plástico. Em seguida, remova cuidadosamente o tampão da superfície do chip glicol usando papel filtro. Coloque o chip glicol de volta na câmara de incubação.
Espalhe a amostra de soro diluído sobre a superfície do chip glicol usando uma micro pipeta. Certifique-se de que todas as áreas secas da superfície do chip glicol estejam cobertas pela amostra de soro diluído usando a ponta da pipeta. Incubar com agitação orbital a 37 graus Celsius por 1 1/2 horas.
Após a incubação, remova qualquer amostra em excesso e mergulhe o chip glicol por cinco minutos no buffer três a 25 graus Celsius. Passe o chip glicol para um recipiente com tampão quatro e, finalmente, lave o chip glicol com água ultra pura. Centrifugar o chip glicol por um minuto a 175 vezes G e 25 graus Celsius para remover o líquido.
Depois de colocar o chip glicol de volta na câmara de incubação, espalhe uma solução de anti-rato de cabra conjugado à biotina sobre a superfície do chip glicol. Incubar com agitação orbital a 37 graus Celsius por uma hora. Retire a fração desvinculada e repita as etapas de lavagem.
Após a centrifugação, incubar o chip glicol na escuridão a 25 graus Celsius por 45 minutos com dois microgramas por mililitro da solução de streptavidina rotulada fluorocromo correspondente no buffer dois. Depois de trabalhar na escuridão para remover a fração desvinculada e repetir os passos de lavagem, seque o chip glicol pelo ar. Para escanear a matriz, deixe o chip glicol sobre a mesa até atingir a temperatura ambiente no escuro.
Ao mesmo tempo, ligue o scanner de slides e o laser. Segurando a micro matriz, deslize o chip glicol para dentro do slot até tocar a parte de trás. Escaneie o chip glicol executando o EasyScan e salve a varredura como um arquivo tif.
Quantifique a matriz usando um sistema de análise ScanArray. Abra as imagens digitalizadas anteriormente clicando no arquivo na configuração e no grupo de arquivos na janela principal. Carregue o modelo de arquivo de matriz correspondente no formato GAL, o que representa a disposição de glícanos impressos no slide de vidro.
Ajuste o modelo GAL alinhando cuidadosamente a matriz com as manchas na imagem e inicie a quantificação. Selecione os perímetros de quantificação como tipo de quantificação executado fácil quant e método de quantificação círculo fixo. Despreseça todas as opções para o auto encontrar pontos e selecione lowess para o método de normalização.
Salve os dados quantificados como um arquivo csv. Transfira esses dados para um arquivo de planilha comum usando o Microsoft Excel ou outro aplicativo apropriado. Camundongos geneticamente idênticos não devem ser considerados como equivalentes imunológicos porque desenvolveram diferentes padrões de anticorpos anti carboidratos naturais.
Como mostrado aqui, apenas 12 especificidades glicocanos foram conservadas. Mostrado aqui, é um exemplo representativo das imagens obtidas a partir de micro chips de varredura usando um scanner florescente. A grade é então alinhada aos pontos em cada sub array.
Os florescentes são detectados para cada ponto e os resultados são transferidos para um arquivo de planilha comum. Após a incubação com soro do mouse, os chips de glico foram escaneados usando um leitor de matriz de varredura. Os dados foram analisados com um sistema de análise de micro array e os resultados foram expressos na RFU como mediana mais de menos o desvio absoluto mediano.
As cores azul e branco representam sinais de ligação de fundo inferiores a 4000 RFU. A cor vermelha representa sinais de ligação positivos maiores ou iguais a 4000 RFU. A maioria das estruturas glicas expostas nos chips glicol não foram reconhecidas pelo repertório de anticorpos antiglicanos circulantes de ratos balp C.
Uma vez dominada esta técnica pode ser feita em cinco horas e 45 minutos se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a tecnologia de matriz de glicon de impressora para investigar o repertório e os níveis de anticorpos anti carboidratos circulantes em amostras de soro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o chip glico deve ser manipulado por uma parte inferior da luz dos óculos.
Onde o código de barras está localizado. Para evitar contato com os glicanos impressos. Além disso, certifique-se de que toda a área seca do chip glico esteja coberta pela amostra de soro diluído usando a ponta da pipeta.
O volume necessário para cobrir totalmente uma única superfície de um chip de glico é de aproximadamente um mililitro. Após este procedimento, outros métodos como o conjunto de suspensão da base da microesfera podem ser feitos para responder a perguntas adicionais relacionadas à detecção flexível de multiplex do perfil de anticorpos antiglicanos. Após sua introdução, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo de moléculas de biomacral e imunologia explorarem uma interação não-proteína glicol no conjunto de pequenos animais.
