이 프로토콜의 전반적인 목표는 인쇄된 글리칸 어레이 기반 기술을 사용하여 작은 동물의 혈청에서 항글리칸 항체를 순환하는 프로파일을 연구하는 것입니다. 이 접근법은 글리칸 구조물에 대하여 항체가 중요한 역할을 하는 몇몇 병리학 조건에서 초기 진단 및 적당한 처리에 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소량의 시료를 사용하여 매우 높은 감도를 가진 수백 개의 글리칸 표적을 동일한 실험 환경에서 측정할 수 있다는 것입니다.
마이크로 어레이를 준비하려면 비접촉 로봇 어레이를 사용합니다. 밀리머 글리칸 50개, 밀리리터 다당 10마이크로그램, 300밀리머 PBS, pH 8.5, n-하이드록시 6계 계피 파생 유리 슬라이드6복제. 각 슬라이드에는 6회 반복된 4개의 서로 다른 하위 배열 블록이 포함되어 있습니다.
모든 단일 하위 어레이는 대조군을 포함한 112가지 글리칸 스팟에 의해 형성됩니다. 슬라이드를 실온의 수분 상자에 1시간 동안 배양합니다. 마이크로 어레이를 차단하려면 실온에서 버퍼를 차단하여 슬라이드를 1 1/2시간 동안 배양합니다.
그런 다음 매우 순수한 물로 글리콜 칩을 씻고 공기로 건조시다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 4를 통해 버퍼 를 준비합니다. 글리콜 칩과 샘플을 준비하려면 실온에 도달할 때까지 테이블에 슬라이드가 있는 저장 상자를 놓습니다.
상자를 열고 글리콜 칩을 이미 젖은 필터 용지로 조절해야 하는 인큐베이션 챔버로 이송하여 실내의 습도를 일정하게 유지합니다. 한편, 1.5 밀리리터 튜브에 있는 완충1로 마우스 혈청을 희석시. 혈청 용액을 소용돌이 믹서로 5초 동안 균질화합니다.
균질화 후, 면역 글로불린 응집을 피하기 위해 수조에서 10 분 동안 37섭씨에서 희석 된 혈청을 배양합니다. 그런 다음 10, 000 배 G 및 섭씨 25도에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 수집하고 침전 된 재료를 폐기하십시오.
글리콜 칩을 인큐베이션 챔버에 조심스럽게 놓습니다. 글리콜 칩 표면에 잔류 물질을 제거하기 위해 버퍼 3의 1 밀리리터로 배양하십시오. 섭씨 25도에서 15분 동안.
글리콜 칩을 수직 위치에 놓고 플라스틱 저스티드 파이펫을 사용하여 버퍼 3 방울로 다시 세척하십시오. 그런 다음 필터 용지를 사용하여 글리콜 칩 표면에서 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 글리콜 칩을 인큐베이션 챔버에 다시 넣습니다.
마이크로 파이펫을 사용하여 희석된 혈청 샘플을 글리콜 칩 표면에 펴보시면 됩니다. 글리콜 칩 표면의 모든 건조한 부위가 파이펫 끝을 사용하여 희석된 혈청 샘플로 덮여 있는지 확인합니다. 1 1/2 시간 동안 섭씨 37도에서 궤도 동요로 배양하십시오.
인큐베이션후, 여분의 시료를 제거하고 25°C에서 완충 3분 동안 글리콜 칩을 담그지. 글리콜 칩을 버퍼 4로 용기에 넣고 마지막으로 초순수물로 글리콜 칩을 씻습니다. 글리콜 칩을 175회 G와 섭씨 25도에서 1분간 원심분리하여 액체를 제거합니다.
글리콜 칩을 인큐베이션 챔버에 다시 넣은 후, 글리콜 칩 표면 위에 비오틴에 공주된 염소 항마우스용액을 확산시다. 1시간 동안 섭씨 37도에서 궤도 동요로 배양합니다. 언바운드 분획을 제거하고 세척 단계를 반복합니다.
원심분리에 따라, 완충 2에 해당 플루오로크롬 라벨 스트렙타비딘 용액의 밀리리터 당 2 마이크로그램으로 45분 동안 25도의 어둠 속에서 글리콜 칩을 배양한다. 어둠 속에서 작업한 후 언바운드 분획을 제거하고 세척 단계를 반복한 후 글리콜 칩을 공기로 건조시다. 어레이를 스캔하려면 글리콜 칩이 어둠 속에서 실온에 도달할 때까지 테이블에 둡니다.
동시에 슬라이드 스캐너와 레이저를 켭니다. 마이크로 어레이를 잡고 글리콜 칩을 슬롯에 밀어 넣고 뒤쪽에 닿을 때까지 밀어 넣습니다. EasyScan을 실행하여 글리콜 칩을 스캔하고 스캔을 tif 파일로 저장합니다.
ScanArray 분석 시스템을 사용하여 배열을 정량화합니다. 메인 창의 구성 및 파일 그룹에서 파일을 클릭하여 이전에 스캔한 이미지를 엽니다. 해당 어레이 파일 템플릿을 GAL 형식으로 로드하여 유리 슬라이드에 인쇄된 글리칸의 소착을 나타냅니다.
배열을 이미지의 반점과 신중하게 정렬하여 GAL 템플릿을 조정하고 정량화를 시작합니다. 정량화 유형이 쉽게 정량화 및 정량화 방법 고정 원을 실행으로 정량화 둘레를 선택합니다. 자동 찾기 반점에 대한 모든 옵션을 클릭하고 정규화 방법에 대한 최저점을 선택합니다.
정량화된 데이터를 csv 파일로 저장합니다. 이 데이터를 Microsoft Excel 또는 다른 적절한 응용 프로그램을 사용하여 일반적인 스프레드시트 파일로 전송합니다. 유전적으로 동일한 마우스는 천연 항탄수화물 항체의 다른 패턴을 개발했기 때문에 면역학적 등가물로 간주되어서는 안됩니다.
여기에 나타난 바와 같이, 12글리칸 특이성만 보존되었다. 여기에 도시된, 플로리스트 스캐너를 사용하여 마이크로 칩 스캐닝에서 얻은 이미지의 대표적인 예입니다. 그런 다음 그리드는 모든 단일 하위 배열의 스팟에 정렬됩니다.
각 스팟에 대해 플로리스트가 감지되고 결과는 공통 스프레드시트 파일로 전송됩니다. 마우스 세럼으로 인큐베이션을 받은 글리코 칩은 스캔 어레이 판독기를 사용하여 스캔했습니다. 데이터는 마이크로 어레이 분석 시스템으로 분석되었고 결과는 중앙값 절대 편차를 뺀 중간 값으로 RFU로 표현되었다.
파란색과 흰색 색상은 4000 RFU 미만의 배경 바인딩 신호를 나타냅니다. 적색은 4000 RFU보다 크거나 같을 수 있는 양수 결합 신호를 나타냅니다. 글리콜 칩에 노출된 대부분의 글리칸 구조는 발프 C 마우스의 순환 항글리칸 항체의 레퍼토리에 의해 인식되지 않았다.
이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 5 시간 45 분 안에 수행 할 수 있습니다. 이 비디오를 본 후에는 프린터 글리코 어레이 기술을 사용하여 혈청 샘플에서 레퍼토리 및 순환 항탄수화물 항체의 수준을 조사하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 이 절차를 시도하는 동안 글리코 칩은 안경 의 하단 부분에 의해 조작되어야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
바코드가 있는 위치입니다. 인쇄 된 글리칸과의 접촉을 피하기 위해. 또한, 글리코 칩의 모든 건조 영역이 파이펫의 끝을 사용하여 희석 된 혈청 샘플에 의해 덮여 있는지 확인합니다.
글리코 칩의 단일 표면을 완전히 커버하는 데 필요한 부피는 약 1 밀리리터입니다. 이 절차에 이어, 마이크로스피어 베이스 서스펜션 어레이와 같은 다른 방법은 항글리칸 항체 프로파일의 유연한 멀티플렉스 검출과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 그것의 소개 후에 이 기술은 작은 동물의 집합에 있는 비 단백질 glycol 상호 작용을 탐구하기 위하여 생물막 분자 및 면역학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
