La différenciation des cellules progénitrices cardiaques, ou CPC, lors de l’amplification nécessite un passage de phase d’un stade proliférant à un stade engagé, et ce protocole utilise une lignée endothéliale efficace dans les CPC. Un avantage majeur de la technique est qu’elle s’applique aux CPC isolés sur la base de plusieurs techniques et de différentes espèces. Ce protocole peut être utilisé pour améliorer les potentiels thérapeutiques des CPC pour la thérapie cellulaire.
Il peut également être utilisé pour étudier les potentiels et les mécanismes de différenciation et comment ceux-ci sont affectés par les maladies cardiaques. Les CPC sont une population inhomogène de cellules dont la forme, la taille et la puissance peuvent différer. Par conséquent, le protocole doit être ajusté en fonction de la sous-population spécifique des CPC utilisés.
Après anesthésier la souris, essuyez sa poitrine avec 70% d’éthanol. À l’aide de ciseaux, couper la peau et la paroi thoracique pour exposer la cavité thoracique. Utilisez des forceps pour soulever le cœur, puis utilisez des ciseaux pour le couper à la base.
Transférer le cœur dans un plat de culture P60 contenant cinq millilitres de PBS froid, puis utiliser des forceps pour pomper le cœur et éjecter le sang des cavités. Placez le cœur dans un plat P60 contenant cinq millilitres de PBS froid et lavez-le. Utilisez de petits ciseaux pour enlever les airs, couper le cœur en deux morceaux longitudinals et les laver en cinq millilitres de PBS glacé.
À l’aide de petits ciseaux, couper les morceaux de cœur en plus petites sections. Ajouter une goutte de solution de sel équilibrée d’un Hank contenant de la collagène B à une concentration d’un milligramme par millilitre, et utiliser une lame de rasoir stérile pour hacher les petits morceaux de cœur à fond. Ensuite, ajouter 2,5 millilitres de la solution collagène B au plat.
Placez le plat à un angle de 30 degrés dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Laissez les morceaux de cœur hachés couver pendant un maximum de 30 minutes tout en les passant à plusieurs reprises à travers une pipette Pasteur toutes les 10 minutes pendant l’incubation. Tout d’abord, ajouter cinq millilitres de HBSS froid complété par 2%FBS aux morceaux de cœur hachés et homogénéisés.
À l’aide d’un filtre de 100 micromètres, filtrer les morceaux du cœur pour enlever tout tissu non digéré. Centrifugeuse à 470 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en cinq millilitres de tampon de lyse de globule rouge.
Incuber sur la glace pendant cinq minutes avec des secousses occasionnelles. Après cela, ajouter 10 millilitres de PBS et filtrer l’échantillon à travers un filtre de 40 micromètres pour exclure les cellules plus grandes, y compris les cardiomyocytes résiduels. Centrifugeuse à 470 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes sans la pause.
Puis, re-suspendre les cellules dans DMEM complété par 10%FBS, visant une concentration cellulaire finale d’un million de cellules par millilitre. Répartir les cellules en deux tubes pour la coloration et le tri, en ajoutant 1,5 millilitres de la solution cellulaire à un tube et 3,5 millilitres au deuxième tube. Ajouter la solution Hoechst et incuber à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes avec retournement occasionnel pour assurer une distribution égale du colorant et empêcher la coagulation des cellules.
La population latérale apparaît au coin inférieur gauche de Hoechst de côté de la population principale. Dans la parcelle FACS, il peut être identifié en fonction du contrôle négatif dans lequel verapamil incite la population latérale à disparaître. Réchauffez-vous de 1 à 37 degrés Celsius et refroidissez la centrifugeuse à quatre degrés Celsius.
Centrifugez les tubes de tri à 470 fois G et à quatre degrés Celsius pendant six minutes. Puis, re-suspendre les cellules en moyenne. Transférez les cellules dans un plat P60 perméable au gaz contenant quatre millilitres d’un plat moyen.
Changez le milieu tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules aient atteint une confluence entre 70 et 80%Culture SP-CPCs pendant deux à trois jours dans les flacons T75 à l’aide de huit millilitres de milieu un dans chaque flacon. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu et rincez doucement le flacon avec cinq millilitres de HBSS chaud. Traiter les cellules avec cinq millilitres de trypsine EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu pour arrêter l’activité de la trypsine, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugeuse à 470 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, suspendez à nouveau les cellules en deux moyennes ou moyennes.
Plaquez les cellules sur des plats P60, placage 250.000 SP-CPCs par plat avec trois millilitres de milieu contenant différentes concentrations de sérum. Après deux jours de culture, recueillir le milieu de chaque plat dans un tube de 15 millilitres pour recueillir les cellules mortes. Essayez de trypsiniser les cellules adhérentes comme décrit précédemment et de recueillir la suspension cellulaire dans le tube de 15 millilitres qui contient le milieu recueilli.
Centrifugeuse à 840 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirer le supernatant et ajouter un millilitre de moyen un ou moyen deux pour le comptage cellulaire. Tacher les SP-CPCs avec du bleu trypan et compter les cellules viables et mortes. Tout d’abord, aspirer le milieu à partir des cellules préparées, et les rincer doucement avec cinq millilitres de HBSS chaud.
Traiter les cellules avec cinq millilitres de trypsine EDTA pendant cinq minutes dans l’incubateur cellulaire. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de moyenne pour arrêter l’activité de la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 470 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.
Aspirer le supernatant et ajouter deux moyens pour le comptage cellulaire. Ensuite, grainez 80 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de culture pré-enduite de six puits avec trois millilitres de deux moyens. Gardez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures, puis changez le milieu de chaque puits à trois millilitres de trois moyens.
Culture de la plaque pendant 21 jours, en changeant le milieu tous les trois jours. Après cela, tacher les cellules avec un marqueur endothélial et effectuer la microscopie de fluorescence pour vérifier la nature endothéliale des cellules différenciées. Tout d’abord, aspirez le milieu des cellules préparées et rincez-les doucement avec cinq millilitres de HBSS chaud.
Traiter les cellules avec deux millilitres de trypsine EDTA pendant cinq minutes dans l’incubateur cellulaire, puis ajouter trois millilitres de trois moyens pour arrêter l’activité de la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 470 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant et ajouter un millilitre de trois moyens, pipetting doucement pour mélanger.
Comptez les cellules et les graines entre 2000 et 4000 cellules dans 100 microlitres de trois à chaque matrice enduite bien d’une plaque de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Après cela, utilisez un microscope à champ lumineux à deux reprises grossissement pour prendre une photo des cellules.
Dans cette étude, des conditions appropriées sont explorées pour la facilitation de l’engagement endothélial de lignée des cellules progénitrices cardiaques. Lorsque la confluence cellulaire est à ou en dessous de 60%, aucune différence significative n’est observée dans les échantillons traités avec 3,5%FBS. Quand les cellules à cette confluence sont traitées avec 0.1%FBS, elles montrent une diminution de la prolifération cellulaire sur la laminine par rapport à la fibronectine, mais ne montrent aucune augmentation de la mort cellulaire.
En revanche, les cellules à une confluence élevée ne montrent aucune différence significative dans la prolifération cellulaire ou la mort cellulaire entre les deux conditions. Les changements dans la forme des cellules semblent être un indicateur des conditions de culture appropriées dans lesquelles la différenciation endothéliale va être couronnée de succès. Dans les sept à 14 jours dans le milieu de différenciation endothéliale, les cultures réussies sont considérées comme contenant de plus grandes cellules avec la morphologie différente.
Fait intéressant, ces cellules ont disparu vers la fin de la phase de différenciation et ont tendance à apparaître en nombre inférieur et à des moments ultérieurs dans les cultures à haute densité. La formation de tube est toujours réussie dans les cellules plaquées à la basse densité et différenciées sur la laminine, alors qu’elle est vue pour la plupart échouer dans les cellules plaquées à haute densité. Tandis que la formation de tube est la plupart du temps infructueuse dans les cellules cultivés sur la fibronectine indépendamment de la densité cellulaire, ceux différenciés à une basse densité forment parfois des tubes rudimentaires.
La concentration de sérum et la densité cellulaire pour induire la lignée endothéliale sont cruciales, et elles doivent être ajustées pour garantir le ralentissement de la prolifération tout en maintenant la viabilité. Lors de l’induction de lignée, les CPC des humains ou les modèles de maladies précliniques peuvent être utilisés pour des études de transplantation cellulaire afin d’évaluer leur potentiel de différenciation in vivo. Ce protocole pourrait aider à étudier ou à établir de nouveaux outils de régénération cardiaque, et il a été précédemment utilisé pour étudier le mécanisme moléculaire de l’engagement précoce de lignée.
