Le principal avantage de cette technique de culture est que vous pouvez obtenir des copépodes vierges tout en contrôlant leur expérience d’appariement et en suivant leur développement. La méthode d’analyse du comportement suivante peut aider à des expériences contrôlées et reproductibles sur le comportement de garde du maté des copépodes Tigriopus qui sont des zooplanctons communs dans les bassins de marées rocheuses. Bien que ces méthodes puissent fournir un aperçu du comportement reproducteur de Tigriopus, elles peuvent également être utilisées pour examiner comment les facteurs génétiques et environnementaux influent sur la physiologie et le comportement de ces copépodes.
Pour commencer, utilisez une pipette Pasteur pour recueillir des femelles gravid portant des œufs d’orange clairs de la culture des stocks. Rincer les femelles à l’aide d’un milieu de culture propre au moyen d’un tuyautage doux. Ensuite, placez chaque femelle dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire à six puits avec un milieu de culture propre.
Ensuite, placez la plaque dans un incubateur pour la culture des femelles jusqu’à ce qu’elles libèrent des sacs d’oeufs. Après la libération des sacs d’œufs, utiliser une pipette Pasteur pour retirer les femelles des puits de l’assiette. Dès que les animaux au premier stade copépodide ou CI commencent à émerger, utilisez une micropipette P-10 pour les recueillir.
Tous les deux ou trois jours, surveillez les puits à la recherche d’exuviae en fusion. Après cela, le sexe des animaux en examinant leur morphologie antenne. Pour identifier correctement les femelles adultes, assurez-vous qu’elles ont déjà fondu cinq exuviae dans les puits de culture parce que les différences de forme des antennes entre les femelles adultes et les juvéniles ne sont pas visiblement significatives dans certaines populations.
Après avoir sélectionné des animaux du stade approprié et du sexe, nourrissez les individus sélectionnés avec de la nourriture finement moulue pour les poissons. Pendant que les animaux mangent, préparez deux plaques de culture cellulaires plates de 48 puits comme chambres d’essai. Après 30 minutes, rincer chaque animal en le pipetting dans une succession de quatre puits d’une plaque de 24 puits rempli d’eau de mer artificielle propre.
Placez ensuite les individus rincés dans les puits des plaques A et B sur le coussin lumineux LED. Laissez les animaux s’acclimater pendant 30 minutes, puis utilisez une pipette Pasteur pour transférer les cibles de la plaque B à la plaque A.Laissez un mâle et une cible interagir dans chaque puits pendant le temps d’observation désigné avant d’arrêter l’enregistrement vidéo. Tout d’abord, examinez la vidéo pour le moment où chaque cible a été transférée dans un puits sur la plaque A.Next, définissez l’initiation d’une tentative de garde par un mâle comme un contact de l’antenne du mâle avec n’importe quelle partie du corps de la cible.
Définissez la fin de la tentative de garde par un mâle comme le point où l’antenne du mâle se détache du corps de la cible. Ensuite, définir l’initiation de la copulation par un pli du corps dorsal d’un mâle, suivie d’une presse répétitive de l’urosome contre celle de la femelle. Tout d’abord, générer un clip vidéo mettant en vedette l’épisode d’intérêt en coupant le film avec un logiciel de montage de films.
Ensuite, ouvrez ImageJ et importez le clip vidéo. Sélectionnez l’option secrète à échelle grise 8 bits pour réduire la mémoire requise pour le traitement de l’image. Ensuite, sélectionnez l’outil de sélection en ligne droite pour l’étalonnage spacial et tracez une ligne de sélection le long du diamètre du puits.
Ouvrez le menu de l’échelle définie et entrez la longueur connue dans la boîte de distance connue et l’unité dans l’unité de la boîte de longueur. Après cela, ouvrez le menu propriétés et entrez l’intervalle de trame dans la boîte d’intervalle d’image. Ouvrez le plugin MTrackJ en sélectionnant les plugins et MtrackJ.
Ensuite, cliquez sur le bouton de suivi dans la fenêtre de dialogue pour ouvrir le menu de configuration de suivi. Vérifiez appliquer curseur local claquer pendant la piste et sélectionnez centroïde foncé comme une fonctionnalité snap. Ensuite, cliquez sur le bouton ajouter dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour commencer le suivi.
Placez un curseur pour couvrir les personnes dans le clip vidéo à suivre. Ensuite, cliquez pour détecter le centroïde foncé de l’objet dans le carré. Pour générer la table de données, cliquez sur la table de mesure dans la fenêtre de dialogue MTrackJ, puis cliquez sur le bouton film pour générer un film avec la trajectoire suivie tracée comme une ligne colorée.
Enfin, cliquez sur le bouton enregistrer dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour enregistrer les résultats, y compris les données dans la trajectoire bidimensionnelle suivie. Dans cette expérience, le comportement de mate-guarding des copépodes de Tigriopus a été enregistré et observé. L’analyse montre une différence dans la durée moyenne des tentatives de garde entre les couples hommes-femmes et les couples hommes-hommes de Tigriopus californicus où les mâles des couples hommes-hommes présentaient une durée relativement plus courte des tentatives que celles des couples hommes-femmes.
Le suivi spatial en deux dimensions des paires de garde nouvellement formées de Tigriopus californicus a révélé que les couples mâles-mâles avaient tendance à montrer une vitesse plus élevée que les paires hommes-femmes dans les trois premières secondes des tentatives de garde. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de l’éthologie, de la biochimie et de la génétique évolutive afin d’explorer le système d’accouplement unique de ce type de copépodes.
