이 배양 기술의 주요 장점은 페어링 경험을 제어하고 개발을 추적하면서 처녀 copepods를 얻을 수 있다는 것입니다. 다음 행동 분석 방법은 바위 조수 풀에서 일반적인 동물 플랑크톤인 티리오푸스 대처포드의 짝보호 동작에 대한 제어 및 재현 가능한 실험을 도울 수 있습니다. 비록 이러한 방법은 Tigriopus의 생식 행동에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다., 그들은 또한 유전 및 환경 요인이 생리학 및 이러한 copepods의 행동에 영향을 보고 사용할 수 있습니다.
먼저 파스퇴르 파이펫을 사용하여 스톡 문화에서 맑은 오렌지 알을 운반하는 중력 암컷을 수집하십시오. 부드러운 파이펫팅을 통해 깨끗한 배양 매체로 여성을 헹노게 하십시오. 다음으로, 각 여성을 깨끗한 배양 배지가 있는 6웰 세포 배양판의 개별 우물에 배치한다.
그런 다음 접시를 인큐베이터에 넣고 계란 주머니를 방출 할 때까지 여성을 배양합니다. 계란 주머니가 방출된 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 접시의 우물에서 암컷을 제거하십시오. 첫 번째 대처 단계 또는 CI에서 동물이 출현하기 시작하자마자 P-10 마이크로 파이프를 사용하여 수집하십시오.
2~3일마다 우물을 모니터링하여 몰드 엑비비아에 대해 모니터링합니다. 그 후, 그들의 안테나 형태를 검사하여 동물을 섹스. 성인 여성을 올바르게 식별하려면 성인 여성과 청소년 사이의 안테나 모양의 차이가 일부 인구에서 눈에 띄게 중요하지 않기 때문에 이미 문화 우물에서 5 개의 exuviae를 몰로 했는지 확인하십시오.
적절한 단계와 성별의 동물을 선택한 후, 잘게 갈은 생선 음식으로 선택된 개인에게 먹이를 주시면 됩니다. 동물이 먹는 동안, 테스트 챔버로 두 개의 48 잘 평평한 바닥 세포 배양 판을 준비합니다. 30분이 지나간 후, 깨끗한 인공 해수로 채워진 24웰 판 4개의 우물로 파이프를 넣음으로써 각 동물을 헹구는다.
그런 다음 헹구는 개인을 LED 라이트 패드에 접시 A와 B의 우물에 놓습니다. 동물이 30분 동안 적응할 수 있도록 한 다음 파스퇴르 파이펫을 사용하여 플레이트 B에서 플레이트 A.Allow 남성 및 대상이 지정된 관찰 시간 동안 각 우물에서 상호 작용한 후 비디오 녹화를 중지합니다. 먼저, 각 대상이 플레이트 A.Next에서 우물로 옮겨졌을 때의 타이밍에 대한 비디오를 검사하고, 대상의 모든 신체 부위와 남성의 안테나의 접촉으로 남성의 보호 시도개시를 정의한다.
남성의 안테나가 모두 대상의 몸에서 분리될 때 남성의 보호 시도를 종료하는 지점으로 정의합니다. 그런 다음, 남성의 등체 굴곡에 의해 교화의 개시를 정의하고, 여성의 비뇨기과에 대한 반복적인 프레스가 뒤따릅니다. 먼저 영화 편집 소프트웨어로 영화를 트리밍하여 관심 있는 에피소드를 담은 비디오 클립을 생성합니다.
그런 다음 ImageJ를 열고 비디오 클립을 가져옵니다. 이미지 처리에 필요한 메모리를 줄이기 위해 은밀한 8비트 그레이스케일 옵션을 선택합니다. 다음으로, 간격 보정을 위해 직선 선택 도구를 선택하고 우물의 직경을 따라 선택 선을 그립니다.
설정된 스케일 메뉴를 열고 알려진 길이를 알려진 거리 상자와 길이 상자 단위에 입력합니다. 이 후 속성 메뉴를 열고 프레임 간격 상자에 프레임 간격을 입력합니다. 플러그인과 MtrackJ를 선택하여 MTrackJ 플러그인을 엽니 다.
그런 다음 대화 상자 창에서 추적 버튼을 클릭하여 추적 구성 메뉴를 엽니다. 트랙 중에 로컬 커서 스냅을 적용하고 어두운 센트로이드를 스냅 기능으로 선택합니다. 다음으로 MTrackJ 대화 상자 창에서 추가 버튼을 클릭하여 추적을 시작합니다.
추적할 비디오 클립의 개인을 커버하기 위해 커서를 배치합니다. 그런 다음 클릭하여 사각형 내의 오브젝트의 어두운 중심을 감지합니다. 데이터 테이블을 생성하려면 MTrackJ 대화 창에서 측정 테이블을 클릭한 다음 동영상 버튼을 클릭하여 추적된 궤적을 컬러 선으로 그려진 동영상을 생성합니다.
마지막으로 MTrackJ 대화 창에서 저장 버튼을 클릭하여 추적된 2차원 궤적의 데이터를 포함하여 결과를 저장합니다. 이 실험에서는 티리오푸스 의 짝 보호 동작이 기록되고 관찰되었다. 분석은 남성 남성 쌍에 있는 남성이 남성-여성 쌍에 있는 그(것)들의 시도의 상대적으로 더 짧은 기간을 전시한 Tigriopus californicus의 남성 여성 쌍과 남성 쌍 사이 보호 시도의 평균 기간에 있는 차이를 보여줍니다.
티리오푸스 칼리포니쿠스의 새로 형성된 보호 쌍의 2차원 공간 추적은 남성-남성 쌍이 가드 시도의 처음 3 초에서 남성 여성 쌍보다 더 높은 속도를 표시하는 경향이 있음을 밝혔다. 개발 후, 이 기술은 윤리학, 생화학 및 진화 유전학 분야의 연구자들이 이러한 유형의 copepods의 독특한 짝짓기 시스템을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
