この培養技術の主な利点は、ペアリング経験を制御し、その開発を追跡しながら、処女のコペポッドを得ることができるということです。以下の行動分析方法は、岩の潮のプールで一般的な動物プランクトンであるティグリオプスコペポッドの仲間守りの挙動に関する制御および再現可能な実験を助けることができる。これらの方法は、Tigriopusの生殖行動に関する洞察を提供することができますが、遺伝的および環境的要因がこれらのコペポッドの生理学的および行動にどのような影響を与えるかを調べるためにも使用できます。
まず、パスツールピペットを使用して、ストック培養から透明なオレンジ色の卵を運ぶグラビッドメスを収集します。穏やかなピペットを介してきれいな培養培地で女性を洗いす。次に、各メスを清潔な培養培地を用いた6ウェル細胞培養板の個々のウェルに入れる。
その後、卵嚢を放出するまでメスを培養するためにインキュベーターにプレートを置きます。卵嚢が放出された後、パスツールピペットを使用してプレートの井戸からメスを取り除きます。最初のコペポディクな段階またはCIの動物が出現し始めるとすぐに、それらを収集するためにP-10マイクロピペットを使用してください。
2~3日ごとに、溶融物の滲出について井戸を監視する。この後、彼らのアンテナ形態を調べることによって動物をセックス。成人女性を正しく識別するには、一部の集団では成人女性と少年の間のアンテナの形状の違いが目に見えて重要ではないので、培養井戸ですでに5つの滲出液を溶融していることを確認してください。
適切な段階と性別の動物を選択した後、細かく粉砕魚の食べ物で選択した個人を養います。動物が食べている間、試験室として2つの48ウェル平底細胞培養プレートを準備する。30分が経過した後、きれいな人工海水で満たされた24ウェルプレートの4つの井戸の連続にそれをピペットで各動物を洗い流します。
その後、LEDライトパッドのプレートAとBの井戸にすすい個体を置きます。動物が30分間順応することを許可し、パスツールピペットを使用してプレートBからプレートAにターゲットを転送します。まず、各ターゲットがプレートAの井戸に移されたタイミングのビデオを調べ、次に、男性がターゲットの任意の身体部分を持つ男性のアンテナの接触としてガードの試みの開始を定義します。
男性のアンテナの両方がターゲットの体から切り離されるポイントとして、男性によるガードの試みの終了を定義します。次に、男性の後部身体屈曲による交尾の開始を定義し、続いてウロソームを女性のそれに対して繰り返しプレスする。まず、映画編集ソフトウェアでムービーをトリミングすることで、興味のあるエピソードをフィーチャーしたビデオクリップを生成します。
次に、ImageJ を開き、ビデオ クリップをインポートします。画像処理に必要なメモリを減らすには、隠された 8 ビットのグレースケール オプションを選択します。次に、スペキシャルキャリブレーション用の直線選択ツールを選択し、ウェルの直径に沿って選択線を描きます。
設定された尺度メニューを開き、既知の距離ボックスに既知の長さを入力し、長さの単位ボックスに単位を入力します。この後、プロパティメニューを開き、フレーム間隔ボックスにフレーム間隔を入力します。プラグインと MtrackJ を選択して、MTrackJ プラグインを開きます。
次に、ダイアログ ウィンドウのトラッキング ボタンをクリックして、トラッキング構成メニューを開きます。トラック中にローカル カーソル スナップを適用し、スナップ フィーチャとして暗い中心点を選択します。次に、MTrackJダイアログウィンドウの追加ボタンをクリックしてトラッキングを開始します。
トラックするビデオクリップの個人をカバーするためにカーソルを置きます。次に、クリックして、正方形内のオブジェクトの暗い中心を検出します。データテーブルを生成するには、MTrackJダイアログウィンドウで測定テーブルをクリックし、ムービーボタンをクリックして、トラック軌道を色付きの線で描いたムービーを生成します。
最後に、MTrackJ ダイアログウィンドウの保存ボタンをクリックして、トラックされた 2 次元軌道のデータを含む結果を保存します。本実験では、ティリオプスコペポッドの仲間守り行動を記録し、観察した。分析は、男性と男性のペアの男性の男性が男性と女性のペアの場合よりも比較的短い試行時間を示したティグリオプスカリフォルニカスの男女ペアとの間のガードの試みの平均期間の違いを示しています。
Tigriopus californicusの新たに形成されたガードペアの2次元空間追跡は、男性と男性のペアがガードの試みの最初の3秒間に男性と女性のペアよりも高い速度を示す傾向があることを明らかにしました。その開発後、この技術は、民族学、生化学、進化遺伝学の分野の研究者が、これらのタイプのコペポッドのユニークな交配システムを探求する道を開きました。
