La principal ventaja de esta técnica de cultivo es que se pueden obtener copépodos vírgenes mientras se controla su experiencia de emparejamiento y se realiza un seguimiento de su desarrollo. El siguiente método de análisis de comportamiento puede ayudar a experimentos controlados y reproducibles sobre el comportamiento de protección de relaciones de posición de los copépodos Tigriopus que son zooplancton comunes en piscinas de mareas rocosas. Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre el comportamiento reproductivo de Tigriopus, también se pueden utilizar para ver cómo los factores genéticos y ambientales afectan la fisiología y el comportamiento de estos copépodos.
Para comenzar, utilice una pipeta Pasteur para recoger hembras gravid que lleven huevos de naranja claros de la cultura de stock. Enjuague las hembras con un medio de cultivo limpio mediante un pipeteo suave. A continuación, coloque cada hembra en un pozo individual de una placa de cultivo celular de seis pozos con un medio de cultivo limpio.
Luego coloque el plato en una incubadora para cultivar a las hembras hasta que liberen sacos de huevo. Después de liberar los sacos de huevo, utilice una pipeta Pasteur para eliminar a las hembras de los pozos de la placa. Tan pronto como los animales en la primera etapa copépodida o CI comiencen a surgir, utilice una micropipeta P-10 para recogerlos.
Cada dos o tres días, monitorea los pozos en busca de exuvias fundadas. Después de esto, sexo los animales mediante el examen de su morfología antena. Para identificar correctamente a las hembras adultas, asegúrese de que ya han mudado cinco exuvias en pozos de cultivo porque las diferencias en forma de antenas entre hembras adultas y juveniles no son visiblemente significativas en algunas poblaciones.
Después de seleccionar animales de la etapa apropiada y el sexo, alimentar a los individuos seleccionados con alimentos de pescado finamente molidos. Mientras los animales comen, prepare dos placas de cultivo de células inferiores planas de 48 pozos como cámaras de prueba. Después de que hayan pasado 30 minutos, enjuague a cada animal en pipeteándolo en una sucesión de cuatro pozos de un plato de 24 pozos lleno de agua de mar artificial limpia.
A continuación, coloque los individuos enjuagados en los pozos de las placas A y B en la almohadilla de luz LED. Permita que los animales se aclimaten durante 30 minutos, luego utilice una pipeta Pasteur para transferir los objetivos de la placa B a la placa A.Permita que un macho y un objetivo interactúen en cada pozo durante el tiempo de observación designado antes de detener la grabación de video. En primer lugar, examine el vídeo para el momento en que cada objetivo fue transferido a un pozo en la placa A.Siguiente, defina el inicio de un intento de protección por parte de un macho como un contacto de la antena del macho con cualquier parte del cuerpo del objetivo.
Defina la terminación del intento de protección por un macho como punto cuando la antena del macho se separa del cuerpo del objetivo. Luego, definir el inicio de la cópula por una curva dorsal del cuerpo de un macho, seguido de una prensa repetitiva del urosoma contra la de la hembra. En primer lugar, generar un clip de vídeo con el episodio de interés mediante el recorte de la película con el software de edición de películas.
A continuación, abra ImageJ e importe el clip de vídeo. Seleccione la opción de escala de grises encubierta de 8 bits para reducir la memoria necesaria para el procesamiento de imágenes. A continuación, seleccione la herramienta de selección de línea recta para la calibración espacial y dibuje una línea de selección a lo largo del diámetro del pozo.
Abra el menú de escala establecido e introduzca la longitud conocida en el cuadro de distancia conocida y la unidad en el cuadro de unidad de longitud. Después de esto, abra el menú de propiedades e introduzca el intervalo de fotogramas en el cuadro de intervalo de fotogramas. Abra el plugin MTrackJ seleccionando plugins y MtrackJ.
A continuación, haga clic en el botón de seguimiento en la ventana de diálogo para abrir el menú de configuración de seguimiento. Active Aplicar ajuste de cursor local durante la pista y seleccione centroide oscuro como operación de forzado de cursor. A continuación, haga clic en el botón Agregar en la ventana de diálogo MTrackJ para iniciar el seguimiento.
Coloque un cursor para cubrir a las personas del clip de vídeo que se va a realizar el seguimiento. A continuación, haga clic para detectar el centroide oscuro del objeto dentro del cuadrado. Para generar la tabla de datos, haga clic en la tabla de medida en la ventana de diálogo MTrackJ y, a continuación, haga clic en el botón de película para generar una película con la trayectoria de seguimiento dibujada como una línea de color.
Por último, haga clic en el botón Guardar en la ventana de diálogo de MTrackJ para guardar los resultados, incluidos los datos en la trayectoria bidimensional rastreada. En este experimento, se registró y observó el comportamiento de protección de compañeros de los copépodos Tigriopus. El análisis muestra una diferencia en la duración media de los intentos de protección entre parejas hombre-mujer y parejas masculinas de Tigriopus californicus donde los machos en las parejas macho-macho mostraron una duración relativamente más corta de los intentos que los de las parejas hombre-mujer.
El seguimiento espacial de dos dimensiones de los pares de protección recién formados de Tigriopus californicus reveló que los pares hombre-masculino tendían a mostrar mayor velocidad que los pares hombre-mujer en los primeros tres segundos de intentos de protección. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la etología, la bioquímica y la genética evolutiva exploraran el sistema de apareamiento único de este tipo de copépodos.
