Der Hauptvorteil dieser Kultivierungstechnik ist, dass Sie jungfräuliche Copepods erhalten können, während Sie ihre Paarungserfahrung steuern und ihre Entwicklung verfolgen. Die folgende Verhaltensanalysemethode kann kontrollierten und reproduzierbaren Experimenten über das Mate-Guarding-Verhalten der Tigriopus Copepods helfen, die in felsigen Gezeitenbecken häufig Zooplankton sind. Obwohl diese Methoden Einen Einblick in das Fortpflanzungsverhalten von Tigriopus geben können, können sie auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie genetische und Umweltfaktoren die Physiologie und das Verhalten dieser Copepoden beeinflussen.
Verwenden Sie zunächst eine Pasteur-Pipette, um gravid Weibchen zu sammeln, die klare orange Eier aus der Bestandskultur tragen. Spülen Sie die Weibchen mit sauberem Kulturmedium durch sanftePipettierung. Als nächstes legen Sie jedes Weibchen in einen individuellen Brunnen einer Sechs-Well-Zell-Kulturplatte mit sauberem Kulturmedium.
Legen Sie dann den Teller in einen Brutkasten, um die Weibchen zu kulturieren, bis sie Eiersäcke loslassen. Nachdem die Eiersäcke losgelassen wurden, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die Weibchen aus den Brunnen der Platte zu entfernen. Sobald Tiere im ersten Copepodid-Stadium oder CI auftauchen, verwenden Sie eine P-10-Mikropipette, um sie zu sammeln.
Alle zwei bis drei Tage, überwachen Sie die Brunnen auf geschmolzene Exuviae. Danach, Sex die Tiere durch die Untersuchung ihrer Antenne Morphologie. Um erwachsene Weibchen richtig zu identifizieren, stellen Sie sicher, dass sie bereits fünf Exuviae in Kulturbrunnen geschmolzen haben, da Unterschiede in der Form der Antennen zwischen erwachsenen Weibchen und Jugendlichen in einigen Populationen nicht sichtbar signifikant sind.
Nach der Auswahl der Tiere der entsprechenden Stufe und des entsprechenden Geschlechts, füttern Sie die ausgewählten Personen mit fein gemahlenen Fischfutter. Während die Tiere essen, bereiten Sie zwei 48-Well-flache Bodenzellenkulturplatten als Prüfkammern vor. Nach 30 Minuten spülen Sie jedes Tier, indem Sie es in eine Reihe von vier Brunnen einer 24-Well-Platte mit sauberem künstlichem Meerwasser gefüllt.
Dann legen Sie die abspülten Individuen in die Brunnen der Platten A und B auf dem LED-Lichtpad. Lassen Sie die Tiere 30 Minuten lang akklimatisieren, und verwenden Sie dann eine Pasteur-Pipette, um die Ziele von Platte B auf Platte A zu übertragen. Erlauben Sie einem Männchen und einem Ziel, in jedem Brunnen für die vorgesehene Beobachtungszeit zu interagieren, bevor Sie die Videoaufzeichnung beenden. Überprüfen Sie zunächst das Video auf das Timing, wenn jedes Ziel in einen Brunnen auf Platte A übertragen wurde.
Definieren Sie den Abbruch des Bewachungsversuchs durch ein Männchen als den Punkt, an dem sich beide Antennen des Männchens vom Körper des Ziels lösen. Definieren Sie dann die Einweihung der Kopulation durch eine dorsale Körperbiegung eines Männchens, gefolgt von einer sich wiederholenden Presse des Urosomes gegen die des Weibchens. Erstellen Sie zunächst einen Videoclip mit der von Interesse interessierten Episode, indem Sie den Film mit einer Filmbearbeitungssoftware beschneiden.
Öffnen Sie dann ImageJ, und importieren Sie den Videoclip. Wählen Sie die verdeckte 8-Bit-Graustufenoption aus, um den für die Bildverarbeitung erforderlichen Speicher zu reduzieren. Wählen Sie als Nächstes das gerade Linienauswahlwerkzeug für die räumliche Kalibrierung aus und zeichnen Sie eine Auswahllinie entlang des Durchmessers des Brunnens.
Öffnen Sie das Menü "Set Scale" und geben Sie die bekannte Länge in das bekannte Entfernungsfeld und die Einheit in das Längenfeld ein. Öffnen Sie anschließend das Eigenschaftenmenü, und geben Sie das Rahmenintervall im Rahmenintervallfeld ein. Öffnen Sie das MTrackJ-Plugin, indem Sie Plugins und MtrackJ auswählen.
Klicken Sie dann auf die Tracking-Schaltfläche im Dialogfenster, um das Menü für die Nachverfolgungskonfiguration zu öffnen. Aktivieren Sie das Fangen eines lokalen Cursors während der Spur und wählen Sie dunkle Schwerpunkte als Fangfunktion aus. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Hinzufügen im MTrackJ-Dialogfenster, um die Nachverfolgung zu starten.
Positionieren Sie einen Cursor, um die Personen im nachzuverfolgenden Videoclip abzudecken. Klicken Sie dann auf , um den dunklen Schwerpunkt des Objekts innerhalb des Quadrats zu erkennen. Um eine Datentabelle zu generieren, klicken Sie im MTrackJ-Dialogfenster auf die Messtabelle, und klicken Sie dann auf die Filmschaltfläche, um einen Film mit der nachverfolgten Flugbahn zu generieren, die als farbige Linie gezeichnet wird.
Klicken Sie schließlich auf die Schaltfläche Speichern im MTrackJ-Dialogfenster, um die Ergebnisse zu speichern, einschließlich der Daten in der verfolgten zweidimensionalen Flugbahn. In diesem Experiment wurde das Mate-Guarding-Verhalten von Tigriopus Copepods aufgezeichnet und beobachtet. Die Analyse zeigt einen Unterschied in der durchschnittlichen Dauer der Bewachungsversuche zwischen männlich-weiblichen Paaren und männlich-männlichen Paaren von Tigriopus californicus, bei denen Männchen in den männlich-männlichen Paaren eine relativ kürzere Dauer der Versuche aufwiesen als die bei männlich-weiblichen Paaren.
Zwei Dimensionen räumliche Verfolgung von neu gebildeten Schutzpaaren von Tigriopus californicus ergaben, dass männlich-männliche Paare dazu neigten, in den ersten drei Sekunden der Bewachungsversuche eine höhere Geschwindigkeit zu zeigen als männlich-weibliche Paare. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern in den Bereichen Ethologie, Biochemie und Evolutionsgenetik den Weg, um das einzigartige Paarungssystem dieser Art von Copepoden zu erforschen.
