Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’intervention thérapeutique immunosuppressrice pour étudier les effets néfastes des médicaments sur la régénération des tissus, en particulier, dans les os. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine les modèles passés de régénération osseuse du poisson zèbre avec l’exposition systémique aux médicaments par immersion du poisson zèbre blessé dans de l’eau de poisson complétée par des médicaments. Avant de commencer la procédure, autoclave une feuille d’aluminium recouvert de 600 millilitres bécher par poisson zèbre et un nombre approprié de bouteilles en verre d’eau de poisson pour l’expérience et de préparer le médicament immunosuppresseur dans des solutions de contrôle expérimental d’intérêt.
Pour une blessure d’amputation, utilisez des forceps contondants pour placer soigneusement un poisson zèbre anesthésié sur son côté latéral sur le couvercle inversé d’une boîte de Pétri de 100 millimètres et utilisez un scalpel pour réséquer 50 % de la nageoire. Placez ensuite le poisson dans un bécher autoclavé contenant 300 millilitres d’eau de poisson complété par un agent expérimental approprié et recouvrez le bécher de papier d’aluminium pour empêcher le poisson zèbre de s’échapper. Pour induire une blessure causée par une fracture de la nageoire, placez un poisson zèbre anesthésié sur le côté latéral dans une boîte de Pétri enduite d’agarose de 100 millimètres sous un microscope disséquant et poussez légèrement une aiguille d’injection dans un segment osseux de rayon d’aileron jusqu’à ce qu’une fissure apparaisse.
Il est important d’introduire pas trop de fractures dans la nageoire, car cela pourrait grandement nuire à la stabilité. Ensuite, transférez le poisson dans un bécher autoclavé contenant 300 millilitres d’eau de poisson complété par l’agent expérimental approprié. Pour générer une lésion calvariale du crâne, maintenez un poisson zèbre anesthésié en position verticale afin que les os calvariaux soient facilement visualisés au microscope à dissection.
Placez une micro-perceuse rotative équipée d’un foret de 500 micromètres au-dessus du centre de l’os frontal et touchez doucement l’os pour produire un trou de la taille de la bavure de forage micro. Il est essentiel de ne pas déplacer la perceuse latéralement tout en produisant la blessure et de s’arrêter immédiatement une fois que la résistance du tissu diminue. Sinon, le cerveau sera endommagé.
Placez ensuite le poisson dans un bécher autoclavé contenant 300 millilitres d’eau de poisson complété par l’agent expérimental approprié. Changez l’eau dans les béchers tous les jours en transférant le poisson zèbre et l’eau de poisson dans un récipient temporaire approprié et en remplissant le bécher avec de l’eau de poisson fraîche complétée par la drogue. Ensuite, utilisez un filet de poisson pour retourner le poisson zèbre à son bécher.
Pour les traitements d’une durée totale de deux jours, ne nourrissez pas le poisson zèbre. Au cours d’expériences plus longues, nourrir le poisson zèbre avec 0,5 à un millilitre d’Artemia SSP éclos tous les deux jours. Pour l’analyse des blessures aux nageoires, récolter l’amende et utiliser des forceps fins pour saisir l’aileron à un bord de la souche.
Utilisez une deuxième paire de forceps pour saisir le bord opposé de la souche et appuyez légèrement sur le tissu sur le fond du plat qui contient froid 4%PFA pendant 10 à 20 secondes. Répétez l’aplatissement des nageoires au besoin. La nageoire doit maintenant être à plat sans curling.
Pour l’entreposage à long terme de l’échantillon après la fixation, lavez le tissu avec trois lavages PBS de 20 minutes et une série ascendante de méthanol. Les échantillons peuvent ensuite être stockés dans 100% méthanol à moins 20 degrés Celsius. Pour la coloration rouge Alizarin, réhydrater les échantillons de méthanol stockés dans une série descendante de méthanol suivie de deux lavages de 20 minutes dans PBS et d’un lavage de cinq minutes dans de l’eau déionisée.
Après le dernier lavage, ajouter alizarin solution rouge au tissu échantillonné et incuber l’échantillon à température ambiante avec basculement pour la période de coloration appropriée. Pour effacer les échantillons, traiter le tissu avec la diminution de 1% potassium hydroxyde glycérol série. Ensuite, stocker les échantillons dans un à un hydroxyde de potassium 0,1% à 80% solution glycérol et monter les tissus avec 80% glycérol pour imaginer.
Pour la coloration de calcéine, incuber jusqu’à trois poissons zèbres simultanément dans 100 millimètres de solution Calcéine pendant 20 minutes dans un bécher en verre recouvert de papier d’aluminium. À la fin de l’incubation, transférer le poisson zèbre dans un récipient d’eau de poisson et laisser les poissons nager brièvement avant de les transférer dans un nouveau récipient d’eau de poisson. Après 20 minutes dans le deuxième bécher pour acquérir des images en direct de la nageoire se régénère, placez un poisson zèbre anesthésié sur une boîte de Pétri enduite d’agarose et imagez la nageoire par microscopie stéréo.
Pour obtenir des images des os régénérants du crâne, placez le poisson zèbre droit dans une éponge et imagez le crâne par microscopie par fluorescence. Le traitement par Prednisolone, semblable à d’autres glucocorticoïdes, conduit à une inhibition globale de la régénération des nageoires, y compris la formation osseuse telle que détectée par Alizarin Red colorant le tissu caudal fixe de nageoire. De même, le médicament a un effet retardant sur la fermeture calvariale des lésions du crâne.
En raison de l’immunosuppression, les nombres réduits de macrophage peuvent également être détectés par immunohistochimie sur des sections congelées de tissu comme démontré en utilisant la coloration anti-mCherry et anti-GFP anticorps et transgénique MPEG-1 mCherry croisé avec Osterix NGFP Zebrafish sur des échantillons de tissu de crâne de Zebrafish des animaux traités prednisolone. Tout en essayant ces procédures, il est important de minimiser la variabilité de la vitesse de régénération osseuse en effectuant les essais de blessure d’une manière hautement reproductible. Il est également crucial pour la maison unique Zebrafish dans les beakers autoclavés contenant de l’eau de poisson autoclavée afin d’éviter l’infection microbienne.
Ce protocole aidera à aborder davantage les mécanismes sous-jacents de l’action glucocorticoïde. Par exemple, dans le contexte de l’ostéoporose induite par le glucocorticoïde et peut également être adapté à l’utilisation d’autres médicaments et d’autres os zebrafish.
