Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des neurosciences en fournissant une méthode plus simple, moins sujette aux erreurs et plus quantitative pour vérifier les lésions et localiser les emplacements des électrodes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la vérification des lésions et des sites d’électrodes dans l’ensemble du cerveau sans avoir besoin de sectionner. Le produit final est un volume numérique 3D du cerveau et plusieurs cerveaux peuvent être traités en parallèle.
Bien que cette méthode sera démontrée chez le rat, elle peut également être appliquée à d’autres organismes, tels que les souris et les pinsons zébrés. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que certaines étapes nécessitent des soins particuliers pour assurer les meilleurs résultats. Pour commencer, placez un cerveau extrait dans une solution de profusion dans un tube conique de 50 millilitres.
Conserver l’échantillon pendant deux à trois jours avec des secousses douces à quatre degrés Celsius. Assurez-vous que l’osmium est dilué dans l’eau et non dans un tampon. C’est parce que l’eau agira comme un détergent doux, permettant à l’osmium de pénétrer profondément dans le tissu.
Préparer 50 millilitres de 2% de tétoxyde d’osmium dans de l’eau double-distillée. Placez ensuite le cerveau dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et ajoutez la solution de tétoxyde d’osmium. Fermez le tube et scellez-le avec du film de paraffine pour éviter les fuites.
Conserver le tube scellé à quatre degrés Celsius avec une légère secousse pendant deux semaines. Assurez-vous que le tube est placé horizontalement. Le cerveau est très épais et un long chemin à parcourir par diffusion.
Placer le tube horizontalement permettra à l’osmium de voyager plus profondément dans le tissu. Après l’incubation de l’échantillon pendant deux semaines, lavez-le avec de l’eau doublement distillée cinq fois pour retirer tout le tétoxyde d’osmium non lié de l’échantillon. Ensuite, lavez l’échantillon avec de l’eau doublement distillée pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Remplacer l’eau doublement distillée par quatre dilutions d’éthanol pour déshydrater l’échantillon. Pour commencer le processus d’infiltration de résine, déplacez l’échantillon à travers trois dilutions de résine d’acétone et trois dilutions de résine d’acétone, puis immerger l’échantillon dans 100% résine à température ambiante pour poursuivre le processus d’infiltration. Après cela, transférer l’échantillon dans un moule jetable.
Infuser l’échantillon de résine fraîche à 100 % pendant quatre heures à température ambiante. Dégazer l’échantillon dans un four à vide pendant 15 minutes à 45 degrés Celsius. Puis guérir l’échantillon dans un four pendant 48 heures à 60 degrés Celsius.
Enfin, lorsque l’échantillon a fini de guérir, décoller le moule jetable et le scanner avec la machine Micro-CT. Dans les sections traditionnelles, l’orientation du cerveau doit être prédéterminée. En utilisant cette méthode micro-CT, le volume numérique du cerveau de l’échantillon peut être manipulé en trois dimensions et pratiquement tranché dans n’importe quelle direction.
La microscopie électronique de balayage du cerveau préparé de rat confirment que le tissu n’a pas été sensiblement endommagé aux fins de la formation image de Micro-CT. Un cerveau de pinsons zébrés a également été préparé et scanné selon ce protocole pour tester l’utilité de cette méthode sur d’autres cerveaux de petits animaux. Cette technique peut être utilisée pour trouver des lésions de surface dans le cerveau, ainsi que des lésions profondément dans le cerveau.
Cette technique peut également être appliquée à l’emplacement des tétrodes simples in situ, des lésions électrolytiques, des traces d’électrodes, des réseaux de tétrode in situ et des sondes de silicium in situ. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de permettre au cerveau d’incuber assez longtemps et avec suffisamment d’agitation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’optogénétique et l’imagerie à deux photons peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur le rôle que jouent les différentes zones cérébrales dans différents comportements.
Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine des neurosciences de mieux explorer les relations structure-fonction entre le cerveau et le comportement chez les rats, les souris, les oiseaux chanteurs et d’autres petits animaux. N’oubliez pas que travailler avec de l’osmium peut être extrêmement dangereux et des précautions, comme le port de gants et le travail dans une hotte sous vide doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
