Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurociência, fornecendo um método mais simples, menos propenso a erros e mais quantitativo para verificar lesões e localizar locais de eletrodos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a verificação de lesões e sítios eletrodos em todo o cérebro sem a necessidade de secção. O produto final é um volume 3D digital do cérebro e múltiplos cérebros podem ser processados em paralelo.
Embora este método seja demonstrado no rato, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como ratos e tentilhões de zebra. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque algumas etapas requerem cuidados particulares para garantir melhores resultados. Para começar, coloque um cérebro extraído em solução de profusão em um tubo cônico de 50 mililitros.
Armazene a amostra por dois a três dias com tremor suave a quatro graus Celsius. Certifique-se de que o ósmio está diluído em água e não em um tampão. Isso porque a água agirá como um detergente suave, permitindo que o ósmio penetrásse profundamente no tecido.
Prepare 50 mililitrois de 2%de tetroxida de 2%de ósseo em água duplamente destilada. Em seguida, coloque o cérebro em um novo tubo cônico de 50 mililitro e adicione a solução de tetroxida de ósmio. Feche o tubo e sele-o com filme de parafina para evitar vazamentos.
Armazene o tubo selado a quatro graus Celsius com agitação suave por duas semanas. Certifique-se de que o tubo está posicionado horizontalmente. O cérebro é muito espesso e uma longa maneira de viajar por difusão.
Colocar o tubo horizontalmente permitirá que o ósmio se aprofunde mais no tecido. Após a amostra incubar por duas semanas, lave-a com água duplamente destilada cinco vezes para remover todo o tetroxida de ósmio não vinculado da amostra. Em seguida, lave a amostra com água duplamente destilada por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Substitua a água duplamente destilada por quatro diluições de etanol para desidratar a amostra. Para iniciar o processo de infiltração da resina, mova a amostra através de três diluições de acetona e três diluições de resina acetona e, em seguida, mergulhe a amostra em 100% de resina à temperatura ambiente para continuar o processo de infiltração. Depois disso, transfira a amostra para um molde descartável.
Infundir a amostra com resina fresca de 100% por quatro horas à temperatura ambiente. Desgas a amostra em um forno a vácuo por 15 minutos a 45 graus Celsius. Em seguida, cure a amostra em um forno por 48 horas a 60 graus Celsius.
Finalmente, quando a amostra terminar de curar, retire o molde descartável e escaneie-o com a máquina Micro-CT. Na seção tradicional, a orientação do cérebro deve ser predeterminada. Usando este método Micro-CT, o volume digital do cérebro amostral pode ser manipulado em três dimensões e praticamente cortado em qualquer direção.
A microscopia eletrônica de varredura do cérebro de rato preparado confirma que o tecido não foi significativamente danificado para fins de micro-tomografia. Um cérebro de passarinho-zebra também foi preparado e escaneado de acordo com este protocolo para testar a utilidade deste método em outros cérebros de animais pequenos. Esta técnica pode ser usada para encontrar lesões superficiais no cérebro, bem como lesões profundas no cérebro.
Esta técnica também pode ser aplicada à localização de tetrodes únicos in situ, lesões eletrolíticas, rastros de eletrodos, matrizes de tetrode in situ e sondas de silício in situ. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de permitir que o cérebro incubasse por tempo suficiente e com agitação suficiente. Após este procedimento, outros métodos como optogenética e imagem de dois fótons podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre o papel que diferentes áreas cerebrais desempenham em diferentes comportamentos.
Essa técnica poderia permitir que pesquisadores do campo da neurociência explorassem melhor as relações estrutura-função entre o cérebro e o comportamento em ratos, ratos, pássaros-canção e outros animais pequenos. Não se esqueça que trabalhar com osmium pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar luvas e trabalhar em um capô de vácuo deve ser sempre tomada durante a realização deste procedimento.
