Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo delle neuroscienze fornendo un metodo più semplice, meno soggetto a errori e più quantitativo per verificare le lesioni e localizzare le posizioni degli elettrodi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la verifica di lesioni e siti di elettrodi in tutto il cervello senza la necessità di sessatura. Il prodotto finale è un volume digitale 3D del cervello e più cervelli possono essere elaborati in parallelo.
Anche se questo metodo sarà dimostrato nel ratto, può anche essere applicato ad altri organismi, come topi e fringuelli zebrati. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché alcuni passaggi richiedono particolare attenzione per garantire i migliori risultati. Per iniziare, posizionare un cervello estratto in soluzione di profusione in un tubo conico da 50 millilitri.
Conservare il campione per due o tre giorni con tremori delicati a quattro gradi Celsius. Assicurarsi che l'osmio sia diluito in acqua e non in un tampone. Questo perché l'acqua fungerà da detergente delicato, permettendo all'osmio di penetrare in profondità nel tessuto.
Preparare 50 millilitri di tetrossido di osmio al 2% in acqua distillata doppia. Quindi posizionare il cervello in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e aggiungere la soluzione di tetrossido di osmio. Chiudere il tubo e sigillare con pellicola di paraffina per evitare perdite.
Conservare il tubo sigillato a quattro gradi Celsius con tremori delicati per due settimane. Assicurarsi che il tubo sia posizionato orizzontalmente. Il cervello è molto spesso e un lungo modo di viaggiare per diffusione.
Posizionare il tubo orizzontalmente consentirà all'osmio di viaggiare più in profondità nel tessuto. Dopo che il campione si incuba per due settimane, lavarlo con acqua doppia distillata cinque volte per rimuovere tutto il tetrossido di osmio non legato dal campione. Quindi, lavare il campione con acqua doppia distillata per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Sostituire l'acqua a doppia distillazione con quattro diluizioni di etanolo per disidratare il campione. Per iniziare il processo di infiltrazione della resina, spostare il campione attraverso tre diluizioni di acetone e tre diluizioni di resina acetone, quindi immergere il campione in resina al 100% a temperatura ambiente per continuare il processo di infiltrazione. Successivamente, trasferire il campione in uno stampo monouso.
Infondere il campione con resina fresca al 100% per quattro ore a temperatura ambiente. Degasare il campione in un forno a vuoto per 15 minuti a 45 gradi Celsius. Quindi polimerizza il campione in forno per 48 ore a 60 gradi Celsius.
Infine, una volta terminato la polimerizzazione del campione, staccare lo stampo monouso e scansionarlo con la macchina Micro-CT. Nel sessatura tradizionale, l'orientamento del cervello deve essere predeterminato. Utilizzando questo metodo Micro-CT, il volume digitale del cervello campione può essere manipolato in tre dimensioni e praticamente tagliato in qualsiasi direzione.
La microscopia elettronica a scansione del cervello del ratto preparato conferma che il tessuto non è stato significativamente danneggiato ai fini dell'imaging Micro-CT. Un cervello di fringuello zebrato è stato anche preparato e scansionato secondo questo protocollo per testare l'utilità di questo metodo su altri piccoli cervelli animali. Questa tecnica può essere utilizzata per trovare lesioni superficiali nel cervello, così come lesioni in profondità nel cervello.
Questa tecnica può anche essere applicata alla posizione di singoli tetrodi in situ, lesioni elettrolitiche, cingoli di elettrodi, array di tetrodi in situ e sonde di silicio in situ. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di consentire al cervello di incubare abbastanza a lungo e con sufficiente agitazione. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'optogenetica e l'imaging a due fotoni possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive sul ruolo che le diverse aree cerebrali svolgono nei diversi comportamenti.
Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare meglio le relazioni struttura-funzione tra il cervello e il comportamento in ratti, topi, uccelli canori e altri piccoli animali. Non dimenticare che lavorare con l'osmio può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come indossare guanti e lavorare in un cappuccio sottovuoto dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
