Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu beantworten, indem sie eine einfachere, weniger fehleranfällige und quantitativemethode zur Überprüfung von Läsionen und zum Lokalisieren von Elektrodenstandorten bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Überprüfung von Läsionen und Elektrodenstellen im gesamten Gehirn ermöglicht, ohne dass schnitter. Das Endprodukt ist ein digitales 3D-Volumen des Gehirns und mehrere Gehirne können parallel verarbeitet werden.
Obwohl diese Methode bei der Ratte nachgewiesen wird, kann sie auch auf andere Organismen wie Mäuse und Zebrafinken angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da einige Schritte besondere Sorgfalt erfordern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um zu beginnen, legen Sie ein extrahiertes Gehirn in Profusion Lösung in einem 50 Milliliter konischen Rohr.
Bewahren Sie die Probe zwei bis drei Tage lang mit sanftem Schütteln bei vier Grad Celsius auf. Stellen Sie sicher, dass das Osmium in Wasser und nicht in einem Puffer verdünnt ist. Dies liegt daran, dass das Wasser als mildes Reinigungsmittel wirkt, so dass das Osmium tief in das Gewebe eindringen kann.
50 Milliliter 2%Osmiumtetroxid in doppelt destilliertem Wasser zubereiten. Dann legen Sie das Gehirn in eine neue 50 Milliliter konische Röhre und fügen Sie die Osmium-Tetroxid-Lösung. Schließen Sie das Rohr und versiegeln Sie es mit Paraffinfolie, um Leckagen zu vermeiden.
Bewahren Sie das versiegelte Rohr bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln für zwei Wochen auf. Stellen Sie sicher, dass das Rohr horizontal platziert ist. Das Gehirn ist sehr dick und ein langer Weg, um durch Diffusion zu reisen.
Wenn Sie das Rohr horizontal platzieren, kann das Osmium tiefer in das Gewebe gelangen. Nachdem die Probe zwei Wochen lang inkubiert wurde, waschen Sie sie fünfmal mit doppelt destilliertem Wasser, um das gesamte ungebundene Osmiumtetroxid aus der Probe zu entfernen. Als nächstes die Probe mit doppelt destilliertem Wasser 30 Minuten bei vier Grad Celsius waschen.
Ersetzen Sie das doppelt destillierte Wasser durch vier Verdünnungen von Ethanol, um die Probe zu dehydrieren. Um den Harzinfiltrationsprozess zu beginnen, bewegen Sie die Probe durch drei Aceton- und drei Acetonharzverdünnungen, und tauchen Sie die Probe dann in 100%Harz bei Raumtemperatur ein, um den Infiltrationsprozess fortzusetzen. Danach die Probe in eine Einwegform übertragen.
Die Probe vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit frischem 100%Harz einfangen. Die Probe im Vakuumofen für 15 Minuten bei 45 Grad Celsius entgasen. Dann die Probe im Ofen für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.
Wenn die Probe ausgehärtet ist, schälen Sie die Einwegform ab und scannen Sie sie mit der Micro-CT-Maschine. Bei der traditionellen Schnitte muss die Orientierung des Gehirns vorbestimmt sein. Mit dieser Micro-CT-Methode kann das digitale Volumen des Probenhirns dreidimensional manipuliert und virtuell in jede Richtung geschnitten werden.
Die Rasterelektronenmikroskopie des präparierten Rattenhirns bestätigt, dass das Gewebe für die Zwecke der Mikro-CT-Bildgebung nicht signifikant geschädigt wurde. Ein Zebrafinkenhirn wurde ebenfalls nach diesem Protokoll vorbereitet und gescannt, um den Nutzen dieser Methode an anderen kleinen Tierhirnen zu testen. Diese Technik kann verwendet werden, um Oberflächenläsionen im Gehirn zu finden, sowie Läsionen tief im Gehirn.
Diese Technik kann auch auf die Position einzelner Tetrodes in situ, elektrolytische Läsionen, Elektrodenspuren, Tetro-Arrays in situ und Siliziumsonden in situ angewendet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, das Gehirn zu erlauben, für lange genug und mit genügend Agitation zu brüten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Optogenetik und Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Rolle zu beantworten, die verschiedene Gehirnbereiche in verschiedenen Verhaltensweisen spielen.
Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ermöglichen, Struktur-Funktions-Beziehungen zwischen Gehirn und Verhalten bei Ratten, Mäusen, Singvögeln und anderen Kleintieren besser zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Osmium extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einer Vakuumhaube, sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
