Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологии, предоставляя более простой, менее подверженный ошибкам, и более количественный метод для проверки поражений и определения местонахождения электродов. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет осуществлять проверку повреждений и электродных участков во всем мозге без необходимости секциохранения. Конечный продукт цифровой 3D объем мозга и несколько мозгов могут быть обработаны параллельно.
Хотя этот метод будет продемонстрирован у крыс, он также может быть применен к другим организмам, таким как мыши и зяблики зебры. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что некоторые шаги требуют особого ухода, чтобы обеспечить наилучшие результаты. Для начала поместите извлеченный мозг в раствор изобилия в 50 миллилитровую коническую трубку.
Храните образец в течение двух-трех дней с нежной тряской при четырех градусах по Цельсию. Убедитесь, что осмий разбавлен в воде, а не буфер. Это потому, что вода будет выступать в качестве мягкого моющего средства, что позволяет осмия проникать глубоко в ткани.
Приготовьте 50 миллилитров 2%осмия тетроксида в двойной дистиллированной воде. Затем поместите мозг в новую 50 миллилитровую коническую трубку и добавьте раствор осмия тетроксида. Закройте трубку и загерметив ее парафиновой пленкой, чтобы предотвратить утечку.
Храните запечатанную трубку при четырех градусах по Цельсию с нежной тряской в течение двух недель. Убедитесь, что трубка расположена горизонтально. Мозг очень толстый и долгий путь, чтобы путешествовать путем диффузии.
Размещение трубки горизонтально позволит осмия путешествовать глубже в ткани. После того, как образец инкубирует в течение двух недель, мыть его с двойной дистиллированной водой пять раз, чтобы удалить все несвежим тетроксидом осмия из образца. Затем промойте образец двойной дистиллированной водой в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Замените двойную дистиллированную воду четырьмя разбавлениями этанола, чтобы обезвоживать образец. Чтобы начать процесс инфильтрации смолы, переместите образец через три ацетона и три разбавления смолы ацетона, затем погрузите образец в 100%-ную смолу при комнатной температуре, чтобы продолжить процесс инфильтрации. После этого перенесите образец в одноразовую форму.
Настоять образец свежей 100%-процентной смолой в течение четырех часов при комнатной температуре. Дега образец в вакуумной духовке в течение 15 минут при температуре 45 градусов по Цельсию. Затем вылечить образец в духовке в течение 48 часов при температуре 60 градусов по Цельсию.
Наконец, когда образец закончил лечение, снять одноразовые формы и сканировать его с Micro-CT машины. В традиционном разделе, ориентация мозга должна быть предопределена. Используя этот метод Micro-CT, цифровой объем мозга образца можно манипулировать в трех измерениях и практически нарезанный в любом направлении.
Сканирование электронной микроскопии подготовленного крысиного мозга подтверждает, что ткань не была существенно повреждена для целей микро-КТ-изображения. Мозг зяблика зебры был также подготовлен и отсканирован в соответствии с этим протоколом, чтобы проверить полезность этого метода на других мелких животных мозгах. Этот метод может быть использован для поиска поверхностных поражений в головном мозге, а также поражения глубоко в головном мозге.
Этот метод также может быть применен к расположению одиночных тетродов на месте, электролитических поражений, электродных дорожек, тетродных массивов на месте и кремниевых зондов на месте. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы мозг инкубировать достаточно долго и с достаточным волнением. После этой процедуры, другие методы, такие как оптогенетика и двух-фотонной визуализации могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о роли различных областях мозга играют в различных поведениях.
Этот метод может позволить исследователям в области неврологии лучше исследовать структуру-функции отношений между мозгом и поведение у крыс, мышей, певчих птиц и других мелких животных. Не забывайте, что работа с осмием может быть чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа в вакуумном капюшоне всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
