Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia proporcionando un método más simple, menos propenso a errores y más cuantitativo para verificar lesiones y localizar ubicaciones de electrodos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la verificación de lesiones y sitios de electrodos en todo el cerebro sin necesidad de seccionamiento. El producto final es un volumen 3D digital del cerebro y múltiples cerebros pueden ser procesados en paralelo.
Aunque este método se demostrará en la rata, también se puede aplicar a otros organismos, como ratones y pinzones de cebra. Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán problemas porque algunos pasos requieren un cuidado particular para asegurar los mejores resultados. Para comenzar, coloque un cerebro extraído en solución de profusión en un tubo cónico de 50 mililitros.
Almacene la muestra durante dos o tres días con un suave temblor a cuatro grados centígrados. Asegúrese de que el osmio se diluye en agua y no en un tampón. Esto se debe a que el agua actuará como un detergente suave, permitiendo que el osmio penetre profundamente en el tejido.
Preparar 50 mililitros de 2%tetróxido de osmio en agua doble destilada. A continuación, coloque el cerebro en un nuevo tubo cónico de 50 mililitro y agregue la solución de tetróxido de osmio. Cierre el tubo y ciérrelo con película de parafina para evitar fugas.
Almacene el tubo sellado a cuatro grados centígrados con un suave temblor durante dos semanas. Asegúrese de que el tubo esté colocado horizontalmente. El cerebro es muy grueso y una larga manera de viajar por difusión.
Colocar el tubo horizontalmente permitirá que el osmio se desdriga más profundamente en el tejido. Después de la incubación de la muestra durante dos semanas, lávela con agua doble destilada cinco veces para eliminar todo el tetróxido de osmio no consolidado de la muestra. A continuación, lave la muestra con agua de doble destilación durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Sustituya el agua de doble destilación por cuatro diluciones de etanol para deshidratar la muestra. Para comenzar el proceso de infiltración de resina, mueva la muestra a través de tres diluciones de resina de acetona y tres de acetona, luego sumerja la muestra en 100% de resina a temperatura ambiente para continuar el proceso de infiltración. Después de esto, transfiera la muestra a un molde desechable.
Infunde la muestra con resina fresca 100% durante cuatro horas a temperatura ambiente. Desgasar la muestra en un horno al vacío durante 15 minutos a 45 grados centígrados. Luego cure la muestra en un horno durante 48 horas a 60 grados centígrados.
Finalmente, cuando la muestra haya terminado de curar, despegue el molde desechable y escanee con la máquina Micro-CT. En la sección tradicional, la orientación del cerebro debe ser predeterminada. Usando este método Micro-CT, el volumen digital del cerebro de muestra puede ser manipulado en tres dimensiones y prácticamente cortado en cualquier dirección.
La microscopía electrónica de barrido del cerebro de rata preparado confirma que el tejido no se dañó significativamente a los efectos de las imágenes Micro-CT. Un cerebro de pinzón cebra también fue preparado y escaneado de acuerdo con este protocolo para probar la utilidad de este método en otros cerebros animales pequeños. Esta técnica se puede utilizar para encontrar lesiones superficiales en el cerebro, así como lesiones profundas dentro del cerebro.
Esta técnica también se puede aplicar a la ubicación de tetrodos individuales in situ, lesiones electrolíticas, pistas de electrodos, matrices de tetrodos in situ y sondas de silicio in situ. Al intentar este procedimiento, es importante recordar permitir que el cerebro incite durante el tiempo suficiente y con suficiente agitación. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la optogenética y las imágenes de dos fotones con el fin de responder preguntas adicionales sobre el papel que desempeñan las diferentes áreas cerebrales en diferentes comportamientos.
Esta técnica podría permitir a los investigadores en el campo de la neurociencia explorar mejor las relaciones estructura-función entre el cerebro y el comportamiento en ratas, ratones, pájaros cantores y otros animales pequeños. No olvide que trabajar con osmio puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como usar guantes y trabajar en una campana de vacío siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.
