Cette vidéo démontrera une méthode simple pour étudier plusieurs gènes candidats dans AML en parallèle, en utilisant le système Crisper-Cas9 combiné avec l’analyse de croissance compétitive basée sur la cytométrie de flux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et évolutive. La démonstration de la procédure sera Bo Rui Chen, un post-doc de notre laboratoire.
Un logiciel de conception CRISPR basé sur le Web est utilisé pour concevoir quatre à six ARN guide unique pour le gène d’intérêt. Pour commencer, remplissez les informations appropriées dans les champs avec des astérisques. Sélectionnez ensuite le génome cible pour la conception d’ARN guide unique.
Coller la séquence cible dans la boîte de séquence, et cliquez sur le bouton soumettre. Pour le clonage dans le plasmide d’expression d’ARN guide unique désiré, prépendez les nucléotides CACC au sens oglionucleotide et AAAC à l’oligonucléotide antisensé gratuit inverse. Le sens prémémixisé et les oligonucléotides antisens sont ensuite commandés auprès d’une entreprise dans une plaque de puits 96, étiquetée Oligo Mix.
Mettez en place une plaque de puits U-Bottom 96 séparée, étiquetée Annealing Plate. Préparez un mélange maître d’un microlitre de kinase polynucléotide T4, d’un microlitre de tampon de ligature de l’ADN 10x T4 et de six microlitres d’eau par réaction annealing. Ajouter 8 microlitres du mélange maître à chaque puits de la plaque Annealing, suivi de 2 microlitres de sens prémémixisé et d’oligonucléotides antisens.
Pipette deux à trois fois doucement pour bien mélanger, puis faire tourner la plaque brièvement pour obtenir les mélanges au fond des puits. Utilisez le programme d’annealage suivant dans une machine PCR. 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, 95 degrés Celsius pendant deux minutes et 30 secondes, suivi d’un refroidissement lent à 22 degrés Celsius à une vitesse de 0,1 degré Celsius par seconde.
Lorsque l’annelage est terminé, préparer une assiette fraîche de 96 puits, étiquetée Mélange Oligo dilué, en diluant les oligonucléotides phosphorylatés et annelés de la réaction annealing un à 200 avec de l’eau. Linéariser le vecteur d’expression de l’ARN guide unique en digérant cinq microgrammes du vecteur avec 1,5 microlitres d’enzyme de restriction BBS1, à l’aide d’un tampon approprié à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, prenez une plaque de Ligation fraîche de 96 plaques bien étiquetées, et ajoutez 20 nanogrammes du vecteur d’expression d’ARN guide unique digéré BBS1 à un puits par ligature d’ARN guide unique désirée.
À cela, ajouter 2 microlitres d’oligonucléotides annelés phosphorylatés de la plaque oligo mix diluée. Ajouter à chaque puits, un microlitre de tampon ligase 10X T4, et un microlitre d’enzyme ligase T4, et doucement pipette à mélanger. Incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures.
Environ 10 minutes avant la fin de la réaction de ligature, remplissez 90 microlitres de cellules E.coli chimiquement compétentes sur la glace. Transférer 10 aliquots microlitres des cellules compétentes dans chaque puits d’une plaque de puits séparée de 96 individuellement. Ajouter le mélange de ligature dans les puits contenant les cellules compétentes.
Pipette de haut en bas doucement, et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Pipette cinq microlitres de la bactérie MÉLANGE D’ADN de chaque réaction de transformation directement dans un puits d’une plaque de 6 puits, contenant de l’agar LB avec 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline. Ajouter environ cinq à huit perles de verre à chaque puits et secouer la plaque de 6 puits huit à dix fois dans un mouvement circulaire.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, choisissez une à deux colonies simples de chaque puits, avec une pointe stérile de pipette de 20 microlitres, et striez-la sur une tache étiquetée sur une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres, avec une agar LB et 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline Après striage sur la plaque LB, éjecter la pointe en trois millilitres de milieu ampicilline dans un tube de fond rond de 14 millilitres , marqué du nombre de clones bactériens correspondant. La plaque bactérienne est ensuite envoyée directement pour le séquençage sanger.
Après une confirmation de séquence du guide unique cloné ARN, purifier l’ADN à partir du tube correspondant de 14 millilitres, à l’aide d’un kit miniprep selon les instructions du fabricant. Les particules lentivirales à ARN guide unique sont produites dans un format de 96 puits, tel que décrit dans le protocole de texte. Et le supernatant viral est immédiatement gelé à moins 80 degrés Celsius.
Un jour avant la transduction des ARN de guide simple dans les cellules cas9 d’AML, enrober une culture non tissulaire plate de fond traitée 96 plaque de puits, avec 100 millilitres de fragment humain recombinant de fibronectine à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Enveloppez la plaque d’une pellicule pour éviter la perte d’évaporation et laissez-la sur le banc pendant la nuit. Le lendemain, retirez le fragment de fibronectine humaine recombinante de chaque puits de la plaque de puits 96.
Décongeler le supernatant viral de chaque ARN guide unique à température ambiante. Ajouter 50 microlitres de supernatant viral de chaque tube à chaque puits enduit de la plaque de transduction. Envelopper la plaque d’une pellicule obstruée pour éviter une contamination potentielle pendant la centrifugation.
Faire tourner la plaque à 1300 fois g à 35 degrés Celsius pendant 90 minutes. Vers la fin de la spinfection, comptez les hautes cellules De Cas9 exprimant le clone B3 de la fiole de culture. Après le comptage, faites tourner le nombre requis de cellules et réutilisez-les dans un milieu frais.
Après la spinfection de 90 minutes, utilisez une pipette multicanal ajustée à 50 microlitres pour enlever le supernatant de tous les puits lentement en inclinant la plaque. Ajouter 100 microlitres de la culture des cellules B3 clone à chaque puits lentement, glissant vers le bas de la jante. Faites tourner la plaque à 1 300 g à 35 degrés Celsius pendant deux minutes pour laisser les cellules s’installer au fond.
Transférer la plaque dans un incubateur de qualité de culture tissulaire de 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter 100 microlitres de milieu frais à chaque puits contenant des cellules transduced à ARN guide unique, de sorte que le volume moyen final est de 200 microlitres. Remettre l’assiette à l’incubateur.
72 heures après la transduction, vérifiez le pourcentage d’ARN guide unique contenant des cellules positives BFP dans chaque puits par cytométrie d’écoulement. Utilisez un colorant de viabilité cellulaire pour marquer et exclure les cellules mortes de l’analyse. Continuer à re-placage d’une proportion des cellules dans de nouveaux puits avec un milieu frais après chaque analyse des faits pour éviter la prolifération pendant l’analyse.
Tous les deux à trois jours, répétez l’analyse des faits pour vérifier la proportion relative de cellules positives bfp par rapport aux homologues négatifs BFP. Analyser le pourcentage de cellules positives BFP pour chaque point de temps, à l’aide d’un logiciel d’analyse des faits. La clé du succès de l’essai de prolifération concurrentiel est d’utiliser les techniques de gating appropriées pour s’assurer que les nombres éventuels de cellules vivantes sont exacts.
Faites glisser les fichiers FCS pour chaque échantillon dans le logiciel. Double clic sur n’importe quel fichier d’échantillon, et tracer une parcelle de point de dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale, avec scatter vers l’avant sur l’axe x, et la dispersion latérale sur l’axe y. Portez toutes les cellules.
Double clic sur les cellules fermée, et tracez la tache de viabilité sur l’axe y par rapport à la hauteur de dispersion avant ou à la parcelle de point de zone. Portez la tache de viabilité des cellules négatives. Double clic sur les cellules vivantes fermées, et tracer BFP sur l’axe y par rapport à la dispersion vers l’avant sur l’axe x.
Portez les cellules positives BFP. Appliquez toutes ces barrières à tous les échantillons en faisant glisser l’échantillon sélectionné sur tous les échantillons sous l’onglet groupe. Cliquez sur l’éditeur de table pour faire une table d’analyse de tous les échantillons.
Faites glisser le compte positif BFP d’un échantillon à la table, et cliquez sur le bouton d’affichage dans l’éditeur de table pour créer un rapport de lot de tous les échantillons, avec la table affichant le pourcentage de cellules positives BFP. Enregistrez la table en tant que fichier Excel. Ce système a été utilisé pour étudier le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle dans la prolifération ou la survie des lignées cellulaires humaines et murines de la LAM.
Cibler le lieu de refuge AAVS1 avec deux ARN à guide unique distinct n’a eu aucun effet sur la prolifération des cellules humaines MOM13 Cas9 En revanche, lorsque le gène associé à la réplication de l’ADN, RPA3, a été ciblé, on a observé une baisse progressive et significative du pourcentage de cellules positives BFP par rapport aux homologues négatifs non traduits du BFP. De même, les effets des ARN à guide unique ciblant Dot1l, un régulateur épigénétique, et rhodopsine, le gène de pigmentation oculaire, ont été testés dans les cellules MLL-AF9 Cas9 de souris. Les ARN à guide unique ciblant Dot1l ont montré une baisse spectaculaire et progressive de la prolifération de la concurrence, contrairement aux ARN à guide unique ciblant la rhodopsine.
Ces résultats démontrent la vulnérabilité de la MLL-AF9 exprimant les cellules leucémiques de masse à l’épuisement de Dot1l, confirmant des résultats précédemment édités. En supposant que quatre à six ARN guides par gène, cette méthode est bien adaptée pour être utilisée pour tester au moins 16 à 24 gènes en parallèle, et elle peut également être appliquée pour tester les dépendances génétiques dans n’importe quelle lignée cellulaire cancéreuse. Dans le cas d’un plus grand nombre de gènes, tels qu’une voie moléculaire entière qui doit être testée dans les cellules de la LAM, les écrans à base de CRISPR-Cas9 seront plus utiles.
