Le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère au cours du développement précoce est actuellement inconnu. Cette technique CRISPR maternelle permet l’identification rapide des gènes d’effet maternel et de leur rôle dans le développement. Le multiplexage guide les ARN vers un seul gène permet aux chercheurs d’identifier de nouveaux phénotypes d’effets maternels en une seule génération.
Cette recherche est bénéfique pour comprendre la fonction des transcrits d’ARNm dans les gamètes, qui sont nécessaires à l’embryogenèse précoce. La clé de cette technique est de micro-injecter les embryons au début du stade d’une cellule, et de vérifier que la majorité des ARN guides peuvent faire des mutations somatiques dans les embryons injectés. Pour créer un modèle d’ARN guide pour chaque oligonucléotide spécifique au gène, analyte à l’oligonucléotide constant et remplir les surplombs avec de l’ADN polymérase T4.
Une fois les quatre modèles d’ARN guides assemblés, purifiez-les et concentrez-les ensemble à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN. Synthétisez le mélange d’ARNg à partir du modèle d’ARN de hauban mis en commun, en utilisant un kit de transcription T7 in vitro, et effectuez la transcription in vitro comme décrit dans le manuscrit. Pour vérifier l’intégrité de l’ARNg, lancez un gel de bromure d’éthidium Tris-Borate-EDTA à 1% d’agarose 0,5 par millilitre.
Placer le gel solidifié dans un tampon de fonctionnement Tris-Borate-EDTA. Mélanger un mélange d’ARNg de microlitre et un tampon de chargement de gel d’ARN de microlitre. Chargez cet échantillon dans le gel et faites fonctionner le gel à 100 volts pendant cinq minutes.
Visualisez les bandes à l’aide de la lumière ultraviolette. Mettez en place des croisements de type sauvage et des boîtes d’accouplement de poisson zèbre. Gardez les poissons mâles et femelles dans le même réservoir, mais séparez-les à l’aide d’un séparateur de boîte d’accouplement, ou comme indiqué ici, en plaçant la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte.
Une fois le cocktail d’injection assemblé, laissez le mâle et la femelle s’accoupler en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou, comme illustré ici, en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle. Pour synchroniser les embryons, prélevez-les après 10 minutes à l’aide d’une passoire en plastique et rincez-les dans une boîte de Petri à l’aide d’un support 1XE3. Prélever 10 à 15 embryons et les placer dans une boîte de Petri séparée pour les conserver comme témoins non injectés.
Transférer les embryons restants dans les puits de la plaque d’injection. Injecter une solution d’ARNg de protéine nanolitre dans le disque blasto en développement d’un embryon unicellulaire. Utilisez une pince pour casser la pointe de l’aiguille obstruée et recalibrez l’aiguille pour éjecter un bolus d’un nanolitre.
Le lendemain de l’injection, prélever six embryons injectés sains et deux embryons témoins dans la plaque non injectée. Placez chaque embryon individuellement dans un seul puits d’un tube en bande PCR et étiquetez le dessus des tubes. Concevoir des amorces de criblage uniques pour chaque site guide afin d’amplifier un fragment d’ADN apparié de 100 à 110 bases qui comprend le site cible CRISPR-Cas9.
Si possible, placez le site cible au milieu du fragment amplifié, ce qui permet d’identifier les délétions plus importantes. Pour chacun des quatre sites cibles guides, mettre en place huit réactions PCR de 25 microlitres en utilisant cinq microlitres d’ADN embryogénomique unique préparé et 20 microlitres du mélange PCR, et guider le mélange d’amorces de criblage spécifiques, afin d’identifier les mutations somatiques dans le site cible. Couler un gel de bromure de tris-borate-EDTA à 2,5 %, 0,5 microgramme par millilitre d’éthidium à l’aide de peignes qui créent des puits d’environ 0,625 centimètre de large.
Placez ensuite le gel solidifié dans la chambre d’électrophorèse contenant le tampon courant Tris-Borate-EDTA. Ajoutez cinq microlitres de colorant de chargement 6X au produit PCR. Chargez 25 microlitres de ce mélange dans le gel, en vous assurant que les échantillons injectés et témoins fonctionnent sur la même rangée de gel.
Une fois tous les échantillons chargés, ajoutez cinq microlitres de bromure d’éthidium par litre de tampon courant Tris-Borate-EDTA, à l’extrémité positive de la boîte de gel. Faites fonctionner le gel à 120 volts jusqu’à ce que les interdictions d’ADN se résolvent ou que l’ADN ait approché de la fin de la voie. Pour identifier les phénotypes d’effet maternel et les embryons maternels de CRISPR, installez les femelles injectées F0 contre les mâles de type sauvage et contrôlez les croisements de type sauvage dans des boîtes d’accouplement standard de poissons zèbres pendant l’après-midi précédant l’expérience.
Placez les poissons mâles et femelles dans le même réservoir, mais séparez-les avec un séparateur de boîte d’accouplement, ou placez la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte. Le matin de l’expérience, laissez le mâle et la femelle commencer à s’accoupler en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle. Prélevez les embryons toutes les 10 minutes en déplaçant l’insert de ponte dans un nouveau fond de réservoir d’accouplement contenant de l’eau fraîche du système, et étiquetez le réservoir avec une étiquette identifiant la femelle F0 individuelle.
Prenez l’ancien réservoir d’accouplement et versez l’eau à travers une passoire en T pour recueillir les embryons d’une couvée individuelle de 10 minutes. Sous un microscope à dissection avec une source de lumière transcendante, observez les embryons en cours de développement toutes les heures, pendant les six à huit premières heures et quotidiennement pendant les cinq jours suivants. Déplacer les embryons CRISPR maternels potentiels vers une boîte de Petri contenant un milieu 1XE3 et tester le phénotype morphologique 24 heures après la fécondation et la viabilité cinq jours après la fécondation.
L’après-midi précédant l’expérience, mettez en place des paires d’accouplement de femelles F0 en gardant les mâles de type sauvage physiquement séparés des femelles, en utilisant un séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant la femelle dans l’insert de ponte. Le matin de l’expérience, retirez la cloison physique pour initier l’accouplement. Au premier signe de ponte, interrompre la reproduction en séparant le mâle et les femelles F0 et garder chaque femelle F0 séparée dans des boîtes d’accouplement individuelles.
Après la fécondation in vitro, laissez les embryons haploïdes se développer jusqu’à ce que le phénotype maternel CRISPR soit observé, et placez ces embryons dans une boîte de Pétri différente. Une fois que les embryons haploïdes CRISPR maternels ont été identifiés, laissez-les se développer pendant au moins six heures après la fécondation. Pour extraire l’ADN génomique d’au moins 10 embryons haploïdes CRISPR maternels, placez un seul embryon haploïde dans un puits individuel d’un tube en bandelette de PCR, retirez l’excès de milieu E3 du puits et ajoutez 50 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires.
Incuber les embryons pendant 20 minutes à 95 degrés Celsius et les refroidir à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’une molaire d’acide trichlorhydrique avec un pH de 7,5 et un vortex de cinq à 10 secondes. Pour identifier les sites guides contenant des indels, concevez des amorces de séquençage pour amplifier un fragment d’ADN comprenant les quatre sites cibles CRISPR / Cas9.
Mettre en place deux 25 microlitres de réactions PCR par embryon, en utilisant cinq microlitres de l’ADN génomique préparé, et les amorces de séquençage. Une fois la PCR terminée, purifiez et concentrez les deux échantillons à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN, et soumettez le fragment d’ADN au séquençage de Sanger, en utilisant les amorces de séquençage avant et arrière. Les ARN guides doivent tous être regroupés avec peu ou pas de chevauchement des régions entre les ARN guides au cours de la génération maternelle de CRISPR.
Si des indels ont été créés, un frottis doit être observé dans les échantillons injectés sur un gel d’agarose, mais pas dans le témoin non injecté. La méthode maternelle CRISPR peut être utilisée pour phénocopier les mutations connues de l’effet maternel, telles que motley, tmi et aura. Pour identifier les lésions génétiques qui contribuent au phénotype maternel CRISPR, les spermatozoïdes traités aux UV et la fécondation in vitro sont combinés pour créer des haploïdes CRISPR maternels.
La création d’un haploïde permet le séquençage de Sanger de l’allèle maternel et l’identification des indels CRISPR maternels. Lors de l’identification d’un phénotype d’effet non maternel, il est essentiel que vous puissiez l’observer chez plusieurs femelles F0, car cela augmente les chances que le phénotype soit causé par une perte de fonction, et non par des effets hors cible ou non spécifiques. Une fois qu’un phénotype d’effet maternel a été identifié, les embryons maternels CRISPR peuvent être utilisés pour examiner les effets sur divers aspects de l’embryogenèse précoce, tels que le squelette sinusal ou la ségrégation de l’ADN.
Cela permet aux chercheurs de comprendre la cause moléculaire du phénotype. Cette méthode teste directement la fonction de gènes inconnus exprimés par la mère en une seule génération, accélérant notre compréhension des processus, agissant au début de l’embryogenèse.
