Cette méthode a répondu à une question clé de la biologie du développement végétaux. C’est-à-dire, quelle est l’importance de la distribution spatiale des stomates? Notre système d’induction pour les stomates groupées utilisant la solution de saccharose est assez facile et directement applicable aux lignées transgéniques ou mutantes d’Arabidopsis thaliana.
Pour commencer, ajouter 1,1 gramme de sels moyens Murashige-Skoog et 15 grammes de saccharose à un bécher. Ajouter 490 millilitres d’eau distillée au bécher et mélanger avec la barre de remue-ménage. Utilisez de l’hydroxyde de potassium pour ajuster le pH à 5,8.
Ensuite, diluer la solution avec 500 millilitres d’eau distillée et transférer la solution diluée dans une bouteille moyenne. Après cela, autoclave la solution. Préparez la solution de stérilisation selon le protocole texte.
Ensuite, en travaillant dans des conditions aseptiques, placez environ 50 graines transgéniques d’A.thaliana portant un marqueur fluorescent dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite un millilitre de 70% d’éthanol au tube et mélanger en inversant le tube cinq fois. Après avoir laissé couler les graines au fond du tube, retirer délicatement l’éthanol à l’aide d’une micropipette.
Ajouter un millilitre de solution de stérilisation aux graines et inverser le tube cinq fois pour mélanger. Retirer délicatement la solution de stérilisation des graines à l’aide d’une micropipette. Ajouter ensuite un millilitre d’eau stérile.
Ajouter 1,5 millilitres de la solution Murashige-Skoog à chaque puits d’une plaque de puits de 24 puits. Ajouter ensuite deux graines stérilisées à chaque puits. À l’aide de deux couches de parafilm, collez le couvercle à la plaque.
Ensuite, transférez la plaque dans une chambre de croissance pour l’incuber pendant 14 jours. Tout d’abord, transférez 30 microlitres de solution Murashige-Skoog de la plaque de puits 24 au centre d’une toboggan en verre. À l’aide de ciseaux disséquants, retirer le cotyledon d’un semis vieux de 14 jours.
Flottez le cotyledon avec le côté observation face vers le haut sur la chute de la solution Murashige-Skoog. Préparez le cotyledon selon les méthodes précédemment décrites dans le Journal of Visualized Experiments. Placez le spécimen sur la scène d’un microscope laser confocal.
Enfin, utilisez l’éclairage du champ lumineux pour sélectionner les cellules de garde groupées pour l’observation. Dans ce protocole, l’amas stomatal a été induit dans les semis d’A.thaliana. Les cellules de garde groupées cultivées dans le saccharose contenant des chloroplastes plus gros que les cellules de garde cultivées dans des conditions sans saccharose.
L’agrandissement des chloroplastes a été confirmé avec un marqueur stroma chloroplaste et des autofluorescents de chlorophylle, suggérant que le traitement de saccharose ait eu comme conséquence l’accumulation de grain d’amidon dans les chloroplastes. En outre, l’observation confocale de la baignoire-6 de GFP a indiqué que les microtubules corticals étaient radialement orientés dans les cellules sucrose-traitées, juste comme dans les cellules de garde saccharose-libres. En fait, nous avons découvert cette méthode par accident.
Après la découverte, nous avons examiné la réponse environnementale des stomates groupées. Nous croyons que notre système pourrait aider à examiner l’importance de la distribution des stomates.
