Este método ha respondido a una cuestión clave de la biología del desarrollo vegetal. Es decir, ¿cuál es la importancia de la distribución espacial de los estomas? Nuestro sistema de inducción para estomas agrupados utilizando solución de sacarosa es bastante fácil y directamente aplicable a las líneas transgénicas o mutantes de Arabidopsis thaliana.
Para empezar, añade 1,1 gramos de sales medianas De Murashige-Skoog y 15 gramos de sacarosa a un vaso de precipitados. Agregue 490 mililitros de agua destilada al vaso de precipitados y mezcle con la barra de agitación. Utilice hidróxido de potasio para ajustar el pH a 5.8.
A continuación, diluir la solución con 500 mililitros de agua destilada y transferir la solución diluida a una botella mediana. Después de esto, autoclave la solución. Preparar la solución de esterilización de acuerdo con el protocolo de texto.
Luego, trabajando en condiciones asépticas, coloque alrededor de 50 semillas transgénicas de A.thaliana que lleven un marcador fluorescente en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue un mililitro de 70% de etanol al tubo y mezcle invirtiendo el tubo cinco veces. Después de permitir que las semillas se hundan en la parte inferior del tubo, retire suavemente el etanol con una micropipeta.
Añadir un mililitro de solución de esterilización a las semillas e invertir el tubo cinco veces para mezclar. Retire suavemente la solución de esterilización de las semillas con una micropipeta. A continuación, agregue un mililitro de agua estéril.
Añadir 1,5 mililitros de la solución Murashige-Skoog a cada pozo de una placa de 24 pozos. Luego agregue dos semillas esterilizadas a cada pozo. Usando dos capas de parafilm, pegue la tapa en la placa.
A continuación, transfiera la placa a una cámara de crecimiento para incubar durante 14 días. En primer lugar, transfiera 30 microlitros de la solución Murashige-Skoog desde la placa de 24 pozos al centro de un portaobjetos de vidrio. Usando tijeras de disección, retire el cotiledón de una plántula de 14 días de edad.
Flote el cotiledone con el lado de observación mirando hacia arriba en la gota de la solución Murashige-Skoog. Preparar el cotiledonen de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el Diario de experimentos visualizados. Ajuste el espécimen en el escenario de un microscopio láser confocal.
Por último, utilice la iluminación de campo brillante para seleccionar celdas de protección agrupadas para la observación. En este protocolo, la agrupación en clústeres estomatales fue inducida en plántulas de A.thaliana. Las células de protección agrupadas cultivadas en la sacarosa que contienen medios que tienen cloroplastos más grandes que las células de protección cultivadas en condiciones libres de sacarosa.
El agrandamiento de los cloroplastos se confirmó con un marcador de estroma de cloroplasto y autofluorescentes de clorofila, lo que sugiere que el tratamiento de sacarosa dio lugar a la acumulación de grano de almidón en los cloroplastos. Además, la observación confocal de la bañera-6 de la GFP reveló que los microtúbulos corticales estaban orientados radialmente en las células tratadas con sacarosa, al igual que en las células de protección libres de sacarosa. En realidad descubrimos este método por accidente.
Después del hallazgo, examinamos la respuesta ambiental de los estomas agrupados. Creemos que nuestro sistema podría ayudar a examinar la importancia de la distribución de estomas.
