Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

Este método respondeu a uma questão-chave da biologia do desenvolvimento vegetal. Ou seja, qual é a importância da distribuição espacial de stomata? Nosso sistema de indução para stomata agrupada usando solução de sacarose é bastante fácil e diretamente aplicável a linhas transgênicas ou mutantes de Arabidopsis thaliana.

Para começar, adicione 1,1 gramas de sais médios Murashige-Skoog e 15 gramas de sacarose a um béquer. Adicione 490 mililitros de água destilada ao béquer e misture com a barra de mexida. Use hidróxido de potássio para ajustar o pH para 5,8.

Em seguida, dilua a solução com 500 mililitros de água destilada e transfira a solução diluída para uma garrafa média. Depois disso, autoclave a solução. Prepare a solução de esterilização de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, trabalhando sob condições assépticas, coloque cerca de 50 sementes transgênicas de A.thaliana carregando um marcador fluorescente em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de 70% de etanol ao tubo e misture invertendo o tubo cinco vezes. Depois de permitir que as sementes afundem no fundo do tubo, remova suavemente o etanol com uma micropipette.

Adicione um mililitro de solução de esterilização às sementes e inverta o tubo cinco vezes para misturar. Remova suavemente a solução de esterilização das sementes com uma micropipette. Em seguida, adicione um mililitro de água estéril.

Adicione 1,5 mililitros da solução Murashige-Skoog a cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, adicione duas sementes esterilizadas a cada poço. Usando duas camadas de parafilm, fita a tampa na placa.

Em seguida, transfira a placa para uma câmara de crescimento para incubar por 14 dias. Primeiro, transfira 30 microliters da solução Murashige-Skoog da placa de 24 poços para o centro de um escorregador de vidro. Usando uma tesoura dissecando, remova o cotilledon de uma muda de 14 dias.

Flutue o cotyledon com o lado de observação voltado para a queda da solução Murashige-Skoog. Prepare o cotyledon de acordo com os métodos descritos anteriormente no Journal of Visualized Experiments. Coloque o espécime no estágio de um microscópio laser confocal.

Finalmente, use iluminação de campo brilhante para selecionar células de guarda agrupadas para observação. Neste protocolo, o agrupamento estomatal foi induzido em mudas de A.thaliana. As células de guarda agrupadas cultivadas na sacarose contendo meio com cloroplastos maiores do que células de guarda cultivadas em condições livres de sacarose.

O alargamento dos cloroplastos foi confirmado com um marcador de estroma cloroplasto e autofluorescentes de clorofila, sugerindo que o tratamento da sacarose resultou no acúmulo de grãos de amido nos cloroplastos. Além disso, a observação confocal da banheira GFP-6 revelou que os microtúbulos corticais eram radialmente orientados nas células tratadas com sacarose, assim como nas células de proteção livre de sacarose. Na verdade, descobrimos esse método por acidente.

Após o achado, examinamos a resposta ambiental de stomata agrupada. Acreditamos que nosso sistema poderia ajudar a examinar o significado da distribuição de stomata.