Questo metodo ha risposto a una domanda chiave sulla biologia dello sviluppo vegetale. Cioè, qual è l'importanza della distribuzione spaziale degli stomi? Il nostro sistema di induzione per stomi raggruppati che utilizzano soluzione di saccarosio è abbastanza semplice e direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutanti della arabidopsis thaliana.
Per iniziare, aggiungere 1,1 grammi di sali medi Di Murashige-Skoog e 15 grammi di saccarosio a un becher. Aggiungere 490 millilitri di acqua distillata al becher e mescolare con la barra di agitazione. Utilizzare idrossido di potassio per regolare il pH a 5,8.
Quindi diluire la soluzione con 500 millilitri di acqua distillata e trasferire la soluzione diluita in una bottiglia media. Dopo questo, autoclave la soluzione. Preparare la soluzione di sterilizzazione secondo il protocollo di testo.
Quindi, lavorando in condizioni asettiche, posizionare circa 50 semi transgenici di A.thaliana che trasportano un marcatore fluorescente in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere quindi un millilitro di 70% di etanolo al tubo e mescolare invertendo il tubo cinque volte. Dopo aver permesso ai semi di affondare sul fondo del tubo, rimuovere delicatamente l'etanolo con una micropipetta.
Aggiungere un millilitro di soluzione di sterilizzazione ai semi e invertire il tubo cinque volte per mescolare. Rimuovere delicatamente la soluzione di sterilizzazione dai semi con una micropipetta. Quindi aggiungere un millilitro di acqua sterile.
Aggiungere 1,5 millilitri della soluzione Murashige-Skoog ad ogni pozzo di una piastra da 24 poggiagli. Quindi aggiungere due semi sterilizzati ad ogni pozzo. Utilizzando due strati di parafilm, rastreliare il coperchio sulla piastra.
Quindi, trasferire il piatto in una camera di crescita per incubare per 14 giorni. In primo luogo, trasferire 30 microlitri della soluzione Murashige-Skoog dalla piastra del pozzo 24 al centro di uno scivolo di vetro. Usando le forbici sezionanti, rimuovere la cotiledone da una piantina vecchia di 14 giorni.
Galleggiare il cotiledone con il lato di osservazione rivolto verso l'alto sulla goccia della soluzione Murashige-Skoog. Preparare il cotiledone secondo i metodi precedentemente descritti nel Journal of Visualized Experiments. Impostare il campione sul palco di un microscopio laser confocale.
Infine, utilizzare l'illuminazione del campo luminoso per selezionare le celle di guardia raggruppate per l'osservazione. In questo protocollo, il clustering stomatale è stato indotto nelle piantine A.thaliana. Le cellule di guardia raggruppate coltivate nel saccarosio contenenti mezzo con cloroplasti più grandi rispetto alle cellule di guardia coltivate in condizioni di esorose.
L'ingrandimento dei cloroplasti è stato confermato con un marcatore stroma cloroplasto e autofluorescenti alla clorofilla, suggerendo che il trattamento con saccarosio ha portato all'accumulo di cereali da amido nei cloroplasti. Inoltre, l'osservazione confocale della vasca-6 della GFP ha rivelato che i microtubuli corticali erano orientati radialmente nelle cellule trattate con saccarosio, proprio come nelle cellule di guardia senza saccarosio. In realtà abbiamo scoperto questo metodo per caso.
Dopo la scoperta, abbiamo esaminato la risposta ambientale degli stomi raggruppati. Riteniamo che il nostro sistema potrebbe contribuire ad esaminare l'importanza della distribuzione degli stomi.
