この方法は、植物発生生物学の重要な問題に答えています。つまり、ストマタの空間分布の重要性は何ですか?ショ糖溶液を用いたクラスター化されたストーマの誘導システムは、かなり簡単で、シロイヌナズナのトランスジェニックまたは変異株に直接適用できます。
まず、1.1グラムのムラシゲ・スクーグ培地塩と15グラムのスクロースをビーカーに加えます。490ミリリットルの蒸留水をビーカーに加え、攪拌バーと混ぜます。水酸化カリウムを使用して、pHを5.8に調整します。
その後、蒸留水500ミリリットルで溶液を希釈し、希釈した溶液を培地ボトルに移します。この後、ソリューションをオートクレーブします。テキストプロトコルに従って殺菌液を準備する。
次いで、無菌状態で働き、蛍光マーカーを運ぶ約50のトランスジェニックA.thaliana種子を1.5ミリリットルのチューブに入れます。次に、70%エタノールの1ミリリットルをチューブに加え、チューブを5回反転して混ぜます。種子をチューブの底に沈めた後、マイクロピペットでエタノールをそっと取り除きます。
種子に殺菌液を1ミリリットル加え、チューブを5回反転して混ぜます。マイクロピペットで種子から殺菌液をそっと取り除きます。その後、滅菌水を1ミリリットル加えます。
24ウェルプレートの各ウェルに1.5ミリリットルのムラシゲスクーグ溶液を加えます。その後、各ウェルに2つの殺菌種子を追加します。パラフィルムの2つの層を使用して、蓋をプレートにテープで貼ります。
次に、プレートを成長チャンバーに移し、14日間インキュベートします。まず、24ウェルプレートからガラススライドの中央に30マイクロリットルのムラシゲスクーグ溶液を移す。解剖ハサミを使用して、14日前の苗からコチルドンを取り除きます。
ムラシゲ・スクーグ溶液の落下液を上に向けて視察側を持つコチルドンを浮かべる。以前に可視化実験のジャーナルで説明した方法に従ってコチルドンを準備します。コンフォーカルレーザー顕微鏡のステージに標本をセットします。
最後に、明視野照明を使用して、観測用のクラスター化されたガードセルを選択します。このプロトコルでは、StomatalクラスタリングがA.thalianaの苗に誘導された。スクロースを含む培地で増殖したクラスター化ガード細胞は、スクロースフリー条件で増殖したガード細胞よりも大きな葉葉芽細胞を有する。
葉芽肉体の拡大は、クロロプラストストロママーカーとクロロフィルの自己蛍光体で確認され、スクロース処理が葉内にデンプン粒蓄積をもたらしたことを示唆した。さらに、GFP tub-6の共焦点観察は、スクロースフリーガード細胞と同様に、皮質微小管がスクロース処理細胞において放射配向であることを明らかにした。実際に私たちは偶然この方法を発見しました。
調査後、クラスター化されたストマタの環境応答を調べた。私たちのシステムは、スマタ分布の重要性を調べるのに役立つと信じています。
