Diese Methode hat eine Schlüsselfrage der Pflanzenentwicklungsbiologie beantwortet. Das heißt, welche Bedeutung hat die räumliche Verteilung von Stomata? Unser Induktionssystem für geclusterte Stomata mit Saccharoselösung ist ziemlich einfach und direkt auf transgene oder mutierte Linien von Arabidopsis thaliana anwendbar.
Zunächst 1,1 Gramm Murashige-Skoog-Mittelsalze und 15 Gramm Saccharose zu einem Becher geben. 490 Milliliter destilliertes Wasser in den Becher geben und mit der Rührstange vermischen. Verwenden Sie Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 5,8 einzustellen.
Anschließend die Lösung mit 500 Milliliter n. Wasser verdünnen und die verdünnte Lösung in eine mittlere Flasche geben. Danach autoklavieren Sie die Lösung. Bereiten Sie die Sterilisationslösung entsprechend dem Textprotokoll vor.
Dann, unter aseptischen Bedingungen arbeiten, legen Sie etwa 50 transgene A.thaliana Samen mit einem fluoreszierenden Marker in eine 1,5 Milliliter-Röhre. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol in die Röhre und mischen, indem Sie das Rohr fünfmal invertieren. Nachdem Sie die Samen auf den Boden der Röhre sinken lassen, entfernen Sie das Ethanol vorsichtig mit einer Mikropipette.
Fügen Sie den Samen einen Milliliter Sterilisationslösung hinzu und kehren Sie die Röhre fünfmal um, um sie zu mischen. Entfernen Sie die Sterilisationslösung vorsichtig mit einer Mikropipette aus den Samen. Dann fügen Sie einen Milliliter steriles Wasser hinzu.
1,5 Milliliter der Murashige-Skoog-Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen. Dann fügen Sie zwei sterilisierte Samen zu jedem Brunnen. Mit zwei Schichten Parafilm, band den Deckel auf die Platte.
Als nächstes übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer, um sie für 14 Tage zu inkubieren. Zuerst übertragen Sie 30 Mikroliter Murashige-Skoog-Lösung von der 24 Well-Platte in die Mitte einer Glasrutsche. Entfernen Sie das Cotyledon mit einer Sezschere von einem 14 Tage alten Sämling.
Schwimmen Sie das Kotyledon mit der Beobachtungsseite nach oben auf den Tropfen der Murashige-Skoog-Lösung. Bereiten Sie das Kotyledon gemäß den zuvor im Journal of Visualized Experiments beschriebenen Methoden vor. Stellen Sie die Probe auf die Stufe eines konfokalen Lasermikroskops.
Verwenden Sie schließlich die helle Feldbeleuchtung, um gruppierte Schutzzellen für die Beobachtung auszuwählen. In diesem Protokoll wurde stomatale Clusterbildung bei A.thaliana Sämlingen induziert. Die in der Saccharose angebauten Wachzellen mit größeren Chloroplasten als Schutzzellen, die unter saccharosefreien Bedingungen angebaut werden.
Die Vergrößerung der Chloroplasten wurde mit einem Chloroplasten-Stroma-Marker und Chlorophyll-Autofluoreszenzen bestätigt, was darauf hindeutet, dass die Saccharosebehandlung zu einer Stärkekornansammlung in den Chloroplasten führte. Zusätzlich ergab die konfokale Beobachtung der GFP-Wanne-6, dass die kortikalen Mikrotubuli in den saccharosebehandelten Zellen radial ausgerichtet waren, genau wie in den saccharosefreien Schutzzellen. Eigentlich haben wir diese Methode zufällig entdeckt.
Nach dem Fund untersuchten wir die Umweltreaktion von clustered stomata. Wir glauben, dass unser System helfen könnte, die Bedeutung der Stomata-Verteilung zu untersuchen.
