Bu yöntem bitki gelişim biyolojisi ile ilgili önemli bir soruyu cevaplayabilmiştir. Yani, stomata mekansal dağılımının önemi nedir? Sakaroz solüsyonu kullanarak kümelenmiş stomata için indüksiyon sistemimiz Arabidopsis thaliana'nın transgenik veya mutant hatlarına oldukça kolay ve doğrudan uygulanabilir.
Başlamak için, bir beher için Murashige-Skoog orta tuzları ve sakaroz 15 gram 1.1 gram ekleyin. Kabına 490 mililitre distile su ekleyin ve karıştırma çubuğu ile karıştırın. pH'ı 5.8'e ayarlamak için potasyum hidroksit kullanın.
Daha sonra çözeltiyi 500 mililitre distile su ile seyreltin ve seyreltilmiş çözeltiyi orta şişeye aktarın. Bundan sonra, otoklav çözüm. Sterilizasyon çözeltisini metin protokolüne göre hazırlayın.
Daha sonra, aseptik koşullar altında çalışan, 1.5 mililitrelik tüp içine bir floresan marker taşıyan yaklaşık 50 transgenik A.thaliana tohumu yerleştirin. Sonraki tüpe% 70 etanol bir mililitre ekleyin ve tüp beş kez ters çevirerek karıştırın. Tohumların tüpün dibine batmasını sağladıktan sonra, etanolü mikropipetle hafifçe çıkarın.
Tohumlara bir mililitre sterilizasyon çözeltisi ekleyin ve tüpü karıştırmak için beş kez ters çevirin. Mikropipet ile tohumlardan sterilizasyon çözeltisini nazikçe çıkarın. Sonra steril su bir mililitre ekleyin.
24 kuyu plakasının her kuyusuna 1,5 mililitre Murashige-Skoog çözeltisi ekleyin. Sonra her iyi iki steril tohum ekleyin. İki kat parafilm kullanarak kapağı tabağa bantlayın.
Daha sonra, 14 gün boyunca kuluçka için bir büyüme odasına plaka aktarın. İlk olarak, 24 kuyu plakasından 30 mikrolitre Murashige-Skoog çözeltisini cam bir kaydıraktan merkezine aktarın. Kesme makası kullanarak, 14 günlük bir fide den cotyledon çıkarın.
Murashige-Skoog çözeltisinin damlasına bakan gözlem tarafı ile cotyledon float. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi'nde daha önce açıklanan yöntemlere göre cotyledon hazırlayın. Örneği konfokal lazer mikroskobun sahnesine ayarlayın.
Son olarak, gözlem için kümelenmiş koruma hücrelerini seçmek için parlak alan aydınlatmasını kullanın. Bu protokolde A.thaliana fidelerinde stomatal kümelenme indüklendi. Sakaroziçermeyen koşullarda yetişen koruyucu hücrelere göre daha büyük kloroplastlara sahip orta madde içeren sakarozda yetişen kümelenmiş koruma hücreleri.
Kloroplastların genişlemesi kloroplast stroma marker ve klorofil otofloresans ile doğrulandı, bu da sakaroz tedavisinin kloroplastlarda nişasta tanelerinin birikmesi ile sonuçlandığını düşündürmektedir. Ayrıca, GFP tub-6 konfokal gözlem kortikal mikrotübüller radyal sakaroz tedavi hücrelerde odaklı olduğunu ortaya koymuştur, sakaroz içermeyen koruma hücrelerinde olduğu gibi. Aslında bu yöntemi kazara keşfettik.
Bulgudan sonra kümelenmiş stomatanın çevresel tepkisini inceledik. Sistemimizin stomata dağılımının önemini nisması için yardımcı olabileceğine inanıyoruz.
