C.elegans toxikologische Assay ist wertvoll. Dieses Protokoll beschreibt, wie C.elegans mit Chemikalien in einer 384-Well-Platte behandelt, Videos erfasst und toxikologische Phänotypen quantifiziert werden. Diese Methode könnte helfen, die potenzielle akute Toxizität einer Chemikalie zu identifizieren und vorherzusagen.
Diese quantitative Technik wurde entwickelt, um die 33 Parameter von C.elegans nach 12 bis 24 Stunden chemischer Behandlung in einer 384-Well-Platte mit flüssigem Medium automatisch zu analysieren. C.elegans ist als gutes Modell für die schnelle Toxizitätsbewertung neuer Chemikalien wertvoll. Als Mäuse, Es kann auf die Toxizität Screening und Prüfung von neuen Chemikalien angewendet werden, oder die Verbindung als Lebensmittelzusatzstoff Agent Verschmutzung, pharmazeutische Verbindung, Umwelt exogene Verbindung, und so weiter.
Lesen Sie das Protokoll sorgfältig und immer folgen Sie mit Schritt für Schritt, dann werden Sie der gute sein. Die visuelle Demonstration ist für den Benutzer einfacher, den Vorgang der einzelnen Schritte und das Ergebnis des Vorgangs anzuzeigen. Die Demonstration des Verfahrens wird Wenjing Zhang und Gaochao Han sein.
Sie sind Doktoranden aus meinem Labor. Um zu beginnen, führen Sie einen vorläufigen Wurm-Letalitätstest für eine neue Chemikalie, um die höchste Dosierung zu bestimmen, und die niedrigste Dosierung, die die minimale Konzentration von 100% Letalität sind, und die maximale Konzentration von 100%nicht-tödlich. Für dieses Experiment sieben Gradientenkonzentrationen von Cadmiumchlorid vorbereiten.
Um das Zweifache der höchsten konzentrierten wässrigen Lösung herzustellen, lösen Sie 92,8 Milligramm Cadmiumchlorid-Festpulver in einem Zentrifugenrohr auf, das mit acht Millilitern K-Medium gefüllt ist. Wirbel zu mischen. Nachdem das Pulver vollständig gelöst ist, verwenden Sie eine Pipette, um bis zu 10 Milliliter zu füllen.
Bereiten Sie die anderen Konzentrationen durch Verdünnung mit K Medium vor. In einer super sauberen Bank, verwenden Sie eine sterile Spitze, um eine einzelne Kolonie von E.coli OP50 aus der Streifenplatte zu pflücken, und legen Sie es in den Kolben mit 100 MilliliterLB-Brühe, um die Kolonie zu impfen. Wachsen Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius im Inkubator-Shaker.
NGM in eine 90 Milliliter Kunststoff-Petriplatte gießen. Samen jede Platte mit 300 Mikroliter E.coli OP50 Lösung. N2-Würmer auf den NGM-Platten mit OP50 bei 20 Grad Celsius für etwa 2 bis 3 Tage inkubieren, bis die meisten Würmer das Erwachsenenstadium erreicht haben.
Mit sterilem Wasser gravid Würmer in ein 15 Milliliter steriles konisches Zentrifugenrohr abwaschen, um sie zu ernten. Lassen Sie die Würmer für mindestens 2 Minuten absetzen. Das Wasser ansaugen und fünf Milliliter Bleichpuffer hinzufügen.
Wirbeln Sie das Rohr für fünf Minuten, und legen Sie dann das Rohr in einer Zentrifuge, um mit einer relativen Zentrifugalkraft von 1300 für 30 Sekunden zu drehen, um die Eier zu pellet. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu aspirieren. Fügen Sie fünf Milliliter sterilisiertes Wasser in die Röhre, um die Eier zu waschen, und wirbeln Sie die Röhre für fünf Sekunden.
Zentrifugieren Sie das Rohr für 30 Sekunden, bei einer relativen Fliehkraft von 1300. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter sterilisiertes Wasser wieder zu waschen. Die Eier auf eine neue NGM-Platte mit OP50 pfeifen.
Bebrüte sie über Nacht bei 20 Grad Celsius. Am nächsten Morgen erreichen die geschlüpften Würmer die L1-Stufe. Nach ca. 40 Stunden erreichen die Würmer die L4-Stufe.
Mit K Medium die L4-Bühnenwürmer von den Petriplatten in ein 50 Milliliter steriles Konusrohr waschen. Pipette 50 Mikroliter der Wurmflüssigkeit aus dem Rohr zu einem Glasschlitten. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Pipette, um die Konzentration von Würmern auf etwa 40 Tiere pro 100 Mikroliter K-Medium einzustellen.
50 Mikroliter des vorbereiteten Mediums in jeden Brunnen der 384-Well-Platte geben. Diese synchronisierten L4-Bühnenwürmer sind bereit für die weitere Behandlung durch Chemikalien. Bevor Sie die Chemikalien hinzufügen, legen Sie die 384-Well-Platte mit den synchronisierten Würmern auf die automatische Bühne und richten Sie eine Videokamera mit dem programmierten Erfassungsverfahren ein.
In der 384-Well-Platte werden Würmer mit sechs bis sieben Dosierungen jeder einzelnen Chemikalie behandelt, mit acht parallelen Brunnen, die 50 Mikroliter der zweifachen chemischen Lösung für jede Dosierung enthalten. Bereiten Sie mindestens drei Gruppen von acht parallelen Brunnen des K-Mediums als Steuerung vor. Fügen Sie 50 Mikroliter der zweifachen chemischen Lösung für jeden Brunnen hinzu.
Legen Sie die Zeit als Null-Stunden-Punkt fest. Dann legen Sie die 384-Well-Platte in den Inkubator-Shaker gesetzt bei 20 Grad Celsius, und 80 Umdrehungen pro Minute. Nach einer gewünschten Zeit die Platte aus dem Inkubator entfernen und auf die automatische Stufe übertragen.
Nehmen Sie Videos von jedem Brunnen der Platte, bei 12 Stunden, und bei 24 Stunden, um die Phänotypen der Würmer zu überprüfen. Um mit der Verarbeitung des experimentellen Videos zu beginnen, übertragen Sie die Videodateien auf den Computer. Klicken Sie über die grafische Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Auswählen, um das Quellbildverzeichnis auszuwählen.
Fügen Sie das mittlere Ergebnisverzeichnis hinzu. Die mittleren Ergebnisse umfassen die segmentierten Bilder, die für die visuelle Beobachtung der verarbeiteten Bilder nützlich sind. Fügen Sie das endgültige Ergebnisverzeichnis in der Schnittstelle hinzu.
Legen Sie den Parameter für die durchschnittliche Wurmgröße im Textfeld Wurmgröße in der Schnittstelle auf 2 000 fest. Legen Sie den Schwellenwert für das bewegte Verhältnis in der Schnittstelle auf 0,93 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Bildverarbeitung zu starten.
Das entwickelte Programm kann Würmer erkennen und Phänotypen automatisch quantifizieren. In diesem Experiment wurden 33 verschiedene Merkmale für die Cadmiumchloridbehandlung zu drei Zeitpunkten, Null-Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden quantifiziert. Experimentelle Bilder zeigen, dass die Würmer schneller starben, als die chemische Konzentration zunahm.
Am Anfang gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrolle und chemischen Behandlungen. Nach 12 Stunden Behandlung wurden die mit hoher Konzentration behandelten Würmer gerader und weniger gekrümmt als bei niedrigeren Konzentrationen oder in Kontrollgruppen. Die Hauptachsenlänge des wurmkörperbedeckten Bereichs nahm mit zunehmender Zeit zu.
Es gibt auch einen Gradiententrend von niedrigeren zu höheren chemischen Konzentrationen sowohl in der Hauptachse als auch in der kleineren Achslänge. Die Würmer-Motilität, basierend auf der Fläche und dem Verhältnis, zeigte ähnliche Muster. Am Anfang wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet.
Im Laufe der Zeit zeigten die Würmer in der Kontrollgruppe eine stabile Abnahme der Beweglichkeit. Nach 12 und 24 Stunden zeigten die mit Cadmiumchlorid behandelten Würmer signifikante Unterschiede in der Beweglichkeit im Vergleich zu Kontrollgruppen. Darüber hinaus zeigten die Würmer unter höherkonzentrationsstärkeren Behandlungen eine schwächere Beweglichkeit im Vergleich zu den Würmern unter Behandlungen mit niedrigerer Konzentration.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik einen Weg zur schnellen Toxizitätsbewertung in mehreren Bereichen ebnet. Forscher, die das Verfahren auf die Notfallanalyse der Toxizität bei lebensmittelbedingter Toxikose, die Sicherheitsbewertung pharmazeutischer Verbindungen sowie das Screening akuter Toxizität und den Nachweis neuer Chemikalien und der umwelt-exogenen Verbindungen anwenden könnten. Das Cadmiumchlorid ist eine niedrig giftige Substanz.
Bitte tragen Sie während der Handhabung Handschuhe und eine Maske und befolgen Sie die Bedienungsanleitung.
