O ensaio toxicológico de C.elegans é valioso. Este protocolo descreve como tratar C.elegans com produtos químicos em uma placa de 384 poços, capturar vídeos e quantificar fenótipos tóxicos relacionados. Este método poderia ajudar a identificar e prever a potencial toxicidade aguda de um produto químico.
Esta técnica quantitativa foi desenvolvida para analisar automaticamente os 33 parâmetros de C.elegans após 12 a 24 horas de tratamento químico em uma placa de 384 poços com meio líquido. C.elegans é valioso como um bom modelo de avaliação rápida de toxicidade para novos produtos químicos. Como camundongos, pode ser aplicado à toxicidade de triagem e testes de novos produtos químicos, ou ao composto como a poluição do agente aditivo alimentar, composto farmacêutico, composto exógeno ambiental, e assim por diante.
Leia o protocolo com atenção e siga sempre o passo a passo, então você será o bom. A demonstração visual é mais fácil para o usuário ver o funcionamento de cada etapa e o resultado da operação. Demonstrando o procedimento estarão Wenjing Zhang e Gaochao Han.
São estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, realize um teste preliminar de letalidade de vermes para um novo produto químico, para determinar a maior dosagem, e a menor dosagem, que são a concentração mínima de 100% de letalidade, e a concentração máxima de 100% não letalidade. Para este experimento, prepare sete concentrações gradientes de cloreto de cádmio.
Para preparar duas vezes a solução aquosa mais concentrada, dissolva 92,8 miligramas de pó sólido de cloreto de cádmio em um tubo de centrífuga cheio com oito mililitros de meio K. Vórtice para misturar. Depois que o pó estiver totalmente dissolvido, use uma pipeta para encher até 10 mililitros.
Prepare os outros níveis de concentração por diluição com o meio K. Em um banco super limpo, use uma ponta estéril para escolher uma única colônia de E.coli OP50 da placa de raia, e colocá-lo no frasco com 100 mililitros de caldo LB para inocular a colônia. Cresça durante a noite a 37 graus Celsius no shaker da incubadora.
Despeje NGM em uma placa de Petri de plástico de 90 mililitros. Semente cada placa com 300 microliters de solução E.coli OP50. Incubar vermes N2 nas placas de NGM com OP50 a 20 graus Celsius por cerca de 2 a 3 dias, até que a maioria dos vermes tenha chegado ao estágio adulto.
Com água estéril, lave vermes gravid em um tubo de centrífuga cônica estéril de 15 mililitros para colher. Deixe os vermes se acalmarem por pelo menos 2 minutos. Aspire a água e adicione cinco mililitros de tampão de alvejante.
Vórtice do tubo por cinco minutos, e depois coloque o tubo em uma centrífuga para girar em uma força centrífuga relativa de 1300 por 30 segundos para pelotar os ovos. Use uma pipeta para aspirar o supernaspe. Adicione cinco mililitros de água esterilizada no tubo para lavar os ovos, e vórtice do tubo por cinco segundos.
Centrifugar o tubo por 30 segundos, a uma força centrífuga relativa de 1300. Remova o sobrenatário e adicione cinco mililitros de água esterilizada para lavar novamente. Pipeta os ovos em uma nova placa NGM com OP50.
Incubar-os a 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, os vermes eclodidos chegam ao estágio L1. Após aproximadamente 40 horas, os vermes chegam ao estágio L4.
Com o meio K, lave os vermes do estágio L4 das placas de Petri em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Pipeta 50 microliters do líquido worm do tubo para um deslizamento de vidro. Sob um microscópio estéreo, use uma pipeta para ajustar a concentração de vermes para aproximadamente 40 animais por 100 microlitros de meio K.
Adicione 50 microliters do meio preparado em cada poço da placa de 384 poços. Estes vermes sincronizados do estágio L4 estão prontos para seguir o tratamento por produtos químicos. Antes de adicionar os produtos químicos, coloque a placa de 384 poços, com os worms sincronizados no palco automático, e configure a câmera de vídeo com o procedimento de aquisição programado.
Na placa de 384 poços, os vermes são tratados com seis a sete doses de cada produto químico individual, com oito poços paralelos contendo 50 microlitadores da solução química de duas vezes para cada dosagem. Prepare pelo menos três grupos de oito poços paralelos de meio K como controle. Adicione 50 microliters da solução química duas vezes para cada poço.
Defina a hora como o ponto zero-hora. Em seguida, coloque a placa de 384 poços no shaker da incubadora a 20 graus Celsius, e 80 revoluções por minuto. Após o tempo desejado, retire a placa da incubadora e transfira-a para o estágio automático.
Faça vídeos de cada poço da placa, às 12 horas, e às 24 horas para verificar os fenótipos dos vermes. Para começar a processar o vídeo experimental, transfira os arquivos de vídeo para o computador. Através da interface gráfica do usuário, clique no botão Selecionar, para escolher o diretório de imagens de origem.
Adicione o diretório de resultados do meio. Os resultados do meio incluem as imagens segmentadas, que são úteis para a observação visual das imagens processadas. Adicione o diretório de resultados finais na interface.
Defina o parâmetro médio de tamanho do worm em 2.000, na caixa de texto Worm Size na interface. Defina o limiar da relação de movimento em 0,93 na interface. Clique no botão Analisar para iniciar o processamento da imagem.
O programa desenvolvido pode reconhecer vermes e quantificar fenótipos automaticamente. Neste experimento, 33 características distintas foram quantificadas para tratamento de cloreto de cádmio em três pontos de tempo, zero hora, 12 horas e 24 horas. Imagens experimentais mostram que os vermes morreram mais rapidamente à medida que a concentração química aumentava.
No início, não houve diferença significativa entre o controle e os tratamentos químicos. Após 12 horas de tratamento, os vermes tratados com alta concentração tornaram-se mais retos e menos curvados do que em concentrações mais baixas ou em grupos de controle. O maior comprimento do eixo da região coberta pelo corpo de vermes aumentou à medida que o tempo aumentava.
Há também uma tendência gradiente de concentrações químicas mais baixas para mais altas tanto no eixo principal quanto no comprimento do eixo menor. A motilidade dos vermes, baseada na área e na razão, mostrou padrões semelhantes. Não foi observada diferença significativa no início.
Com o passar do tempo, os vermes do grupo controle apresentaram uma diminuição estável da motilidade. Após 12 e 24 horas, os vermes tratados com cloreto de cádmio apresentaram diferenças significativas na motilidade, em comparação com os grupos de controle. Além disso, os vermes sob tratamentos de maior concentração mostraram uma motilidade mais fraca, em comparação com os vermes sob tratamentos de menor concentração.
Em resumo, essa técnica abre uma forma de rápida avaliação da toxicidade em múltiplas áreas. Pesquisadores que poderiam aplicar o método à análise emergencial da toxicidade na toxicose transmitida por alimentos, a avaliação de segurança de compostos farmacêuticos, bem como o rastreamento de toxicidade aguda, e a detecção de novos produtos químicos, e os compostos exógenos ambientais. O cloreto de cádmio é uma substância tóxica baixa.
Por favor, use luvas e uma máscara durante o manuseio, e siga as instruções de operação.
