線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

C.elegans毒物学的アッセイは貴重です。このプロトコルは、384ウェルプレートの化学物質でC.elegansを処理し、ビデオをキャプチャし、毒物学的関連表現型を定量化する方法を説明します。この方法は、化学物質の潜在的な急性毒性を同定し、予測するのに役立つ可能性があります。

この定量技術は、液体媒体を用いた384ウェルプレートでの12〜24時間の化学処理後にC.elegansの33パラメータを自動的に分析するために開発されました。C.elegansは、新しい化学物質の迅速な毒性評価の良いモデルとして貴重です。マウスとして、新しい化学物質の毒性スクリーニングや試験、または食品添加剤として汚染する化合物、医薬化合物、外因性化合物等の環境に適用することができる。

プロトコルを注意深く読んで、常にステップバイステップで従ってください、そして、あなたは良いものになるでしょう。視覚的なデモンストレーションは、ユーザーが各ステップの操作と操作の結果を見やすくします。この手順のデモンストレーションは、張と高茶ハンを含みます。

彼らは私の研究室の大学院生です。まず、新しい化学物質の予備的なワーム致死性試験を実施し、最高用量を決定し、最低用量(最低濃度は100%致死率)、最大濃度は100%非致死性である。この実験では、塩化カドミウムの7つの勾配濃度を調製する。

最高の濃縮水溶液の2倍を調製するには、8ミリリットルのK培地で満たされた遠心管に塩化カドミウム固形粉92.8ミリグラムを溶解する。混ぜる渦。粉末が完全に溶解した後、ピペットを使用して最大10ミリリットルを充填します。

K培地で希釈して他の濃度レベルを調製する。超クリーンベンチでは、無菌の先端を使用してストリークプレートから大腸菌OP50の単一コロニーを選び、100ミリリットルのLBスープでフラスコに入れてコロニーを接種します。インキュベーターシェーカーで摂氏37度で一晩育ててください。

90ミリリットルのプラスチックペトリプレートにNGMを注ぎます。各プレートに300マイクロリットルの大腸菌OP50溶液をシードします。N2ワームは、ほとんどのワームが成人期に達するまで、20°CのOP50を2〜3日間、2〜3日間インキュベートします。

滅菌水で、15ミリリットルの無菌円錐形遠心分離管にグラビッドワームを洗い流して収穫します。ワームは少なくとも2分間落ち着かせてください。水を吸い込み、5ミリリットルの漂白剤バッファーを追加します。

チューブを5分間ボルテックスし、遠心分離機にチューブを入れ、1300の相対的な遠心力で30秒間回転し、卵をペレットします。上清を吸引するためにピペットを使用してください。卵を洗うためにチューブに殺菌水5ミリリットルを加え、チューブを5秒間渦に入れます。

1300の相対遠心力で、30秒間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、滅菌水を5ミリリットル加え、再び洗浄します。OP50と新しいNGMプレートに卵をピペット。

一晩摂氏20度でインキュベートします。翌朝、孵化したワームはL1ステージに達する。約40時間後、ワームはL4段階に達する。

K培地では、L4段虫をペトリプレートから50ミリリットルの無菌コニカルチューブに洗い流します。管からガラススライドへのワーム液のピペット50マイクロリットル。ステレオ顕微鏡では、ピペットを使用して、K培地の100マイクロリットルあたり約40匹の動物にワームの濃度を調整します。

調製した培地の50マイクロリットルを384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これらの同期されたL4段階のワームは、化学物質による治療に従う準備ができています。化学物質を追加する前に、同期化されたワームを自動ステージに置いて384ウェルプレートを配置し、プログラムされた取得手順でビデオカメラを設定します。

384ウェルプレートでは、ワームは各個々の化学物質の6〜7用量で処理され、8つの平行井戸には2回の化学溶液の50マイクロリットルが含まれています。コントロールとしてK培地の8つの平行ウェルの少なくとも3つのグループを準備します。各井戸に対して2倍の化学溶液の50マイクロリットルを加えます。

時間をゼロ時間ポイントとして設定します。その後、384ウェルプレートを摂氏20度に設定したインキュベーターシェーカーに入れ、毎分80回転します。所望の時間の後、インキュベーターからプレートを取り出し、自動段階に移します。

12時間、24時間でプレートの各井戸のビデオを撮り、ワームのフェノタイプをチェックします。実験ビデオの処理を開始するには、ビデオファイルをコンピュータに転送します。グラフィカルユーザーインターフェイスを介して、ソース画像ディレクトリを選択するために、選択ボタンをクリックします。

中間結果ディレクトリを追加します。中間の結果には、セグメント化された画像が含まれ、処理された画像の視覚的な観察に役立ちます。インターフェイスに最終結果ディレクトリを追加します。

インターフェイスの [ワーム サイズ] テキスト ボックスで、ワーム サイズの平均パラメータを 2,000 に設定します。インターフェイスで移動比率のしきい値を 0.93 に設定します。[解析] ボタンをクリックして、画像処理を開始します。

開発されたプログラムは、ワームを認識し、自動的に型を定量することができます。本実験では、33の特徴的な特徴を、3つの時点、ゼロ時間、12時間、24時間で塩化カドミウム処理のために定量した。実験画像は、化学物質濃度が増加するにつれて、ワームがより迅速に死んだことを示しています。

当初、コントロールと化学処理の間に有意な差はなかった。12時間の治療の後、高濃度で処理されたワームは、より低い濃度または対照群よりもまっすぐかつ湾曲しなくなった。ワームボディを覆う領域の長軸長は、時間が増加するにつれて増加した。

また、長軸と短軸の長さの両方で、より低い化学濃度から高い化学濃度への勾配傾向もあります。ワームの運動性は、面積と比率に基づいて、同様のパターンを示した。最初に有意差は認められなかった。

時間が経つにつれて、対照群のワームは運動性の安定した減少を示した。12時間及び24時間後、塩化カドミウムで処理したワームは、対照群と比較して運動性に有意な差を示した。さらに、より高濃度治療の下でのワームは、より低濃度の治療下のワームと比較して、弱い運動性を示した。

要約すると、この技術は、複数の領域で迅速な毒性評価の方法を開きます。食品媒介性毒物症の毒性の緊急解析、医薬品化合物の安全性評価、急性毒性スクリーニング、新薬品の検出、環境外因性化合物に応用できる研究者。塩化カドミウムは、低毒性物質である。

取扱い時に手袋とマスクを着用し、操作手順に従ってください。