Токсикологический анализ C.elegans ценен. Этот протокол описывает, как лечить C.elegans с химическими веществами в 384-колодец пластины, захват видео, и количественно токсикологических связанных фенотипов. Этот метод может помочь определить и предсказать потенциальную острую токсичность химического вещества.
Этот количественный метод был разработан для автоматического анализа 33 параметров C.elegans после 12 до 24 часов химической обработки в 384-хорошо пластины с жидкой средой. C.elegans ценен как хорошая модель быстрой оценки токсичности для новых химических веществ. Как мыши, он может быть применен к скрининга токсичности и тестирования новых химических веществ, или соединения, как пищевые добавки агента загрязнения, фармацевтические соединения, окружающей среды экзогенных соединений, и так далее.
Читайте протокол внимательно и всегда следуйте шаг за шагом, то вы будете хорошим. Визуальная демонстрация проще для пользователя, чтобы увидеть работу каждого шага, и результат операции. Демонстрацией процедуры будут Вэньцзин Чжан и Гаочао Хань.
Они аспиранты моей лаборатории. Для начала проведем предварительный тест на летальность червя для нового химического вещества, чтобы определить самую высокую дозировку, и самую низкую дозировку, которые являются минимальной концентрацией 100% летальности, и максимальной концентрацией 100% нелетальной. Для этого эксперимента приготовьте семь градиентных концентраций хлорида кадмия.
Чтобы подготовить в два раза самый высокий концентрированный аковый раствор, растворите 92,8 миллиграмма твердого порошка хлорида кадмия в центрифуге трубки, наполненной восемью миллилитров K среды. Вихрь смешивать. После полного растворения порошка используйте пипетки для заполнения до 10 миллилитров.
Подготовьтесь к другим уровням концентрации путем разбавления K средой. В супер чистой скамейке, используйте стерильный наконечник, чтобы выбрать одну колонию E.coli OP50 из полосы пластины, и поместите его в колбу со 100 миллилитров бульона LB, чтобы привить колонии. Вырастить его на ночь при 37 градусах по Цельсию в инкубатор шейкер.
Налейте NGM в 90 миллилитров пластиковой пластины Петри. Семя каждой пластины с 300 микролитров E.coli OP50 раствора. Инкубировать N2 червей на ngM пластин с OP50 при 20 градусах по Цельсию в течение 2 до 3 дней, пока большинство червей достигли стадии взрослого.
С стерильной водой, запить гравидных червей в 15 миллилитров стерильных конической центрифуги трубки для сбора урожая. Пусть черви успокоиться, по крайней мере 2 минуты. Аспирировать воду и добавить пять миллилитров буфера отбеливателя.
Vortex трубки в течение пяти минут, а затем положить трубку в центрифугу, чтобы спина на относительную центробежную силу 1300 в течение 30 секунд, чтобы гранулировать яйца. Используйте пипетку, чтобы аспирировать супернатанта. Добавить пять миллилитров стерилизованной воды в трубку, чтобы мыть яйца, и вихрь трубки в течение пяти секунд.
Центрифуга трубки в течение 30 секунд, при относительной центробежной силе 1300. Удалить супернатант и добавить пять миллилитров стерилизованной воды, чтобы мыть снова. Пипетт яйца на новую пластину NGM с OP50.
Инкубировать их при 20 градусах по Цельсию в одночасье. На следующее утро вылупившихся червей достичь стадии L1. Примерно через 40 часов черви достигают стадии L4.
С K среды, мыть L4 этапе червей от Петри пластин в 50 миллилитров стерильной конической трубки. Пипетка 50 микролитров червя жидкости из трубки в стеклянную горку. Под стерео микроскопом используйте пипетки для регулировки концентрации червей примерно до 40 животных на 100 микролитров K среды.
Добавьте 50 микролитров подготовленной среды в каждый колодец из 384-хорошо пластины. Эти синхронизированные L4 стадии червей готовы к следующей обработке химическими веществами. Перед добавлением химических веществ, поместите 384-хорошо пластины, с синхронизированными червями на автоматической сцене, и настроить видеокамеру с запрограммированной процедурой приобретения.
В 384-хорошо пластины, черви обрабатываются с шестью-семью дозировками каждого отдельного химического вещества, с восемью параллельными скважинами, содержащими 50 микролитров в два раза химический раствор для каждой дозы. Подготовь в качестве управления по крайней мере три группы из восьми параллельных скважин K medium. Добавьте 50 микролитров химического раствора в два раза для каждой колодец.
Установите время в качестве нулевой точки часа. Затем положите пластину 384-колодец в инкубатор шейкер установлен на 20 градусов по Цельсию, и 80 оборотов в минуту. После желаемого времени снимите пластину с инкубатора и перенесите ее на автоматическую стадию.
Возьмите видео каждого колодец пластины, в 12 часов, и в 24 часов, чтобы проверить фенотипы червей. Чтобы начать обработку экспериментального видео, перенесите видеофайлы на компьютер. Через графический пользовательский интерфейс нажмите кнопку Выберите, чтобы выбрать исходный каталог изображений.
Добавьте каталог среднего результата. Средние результаты включают сегментированные изображения, которые полезны для визуального наблюдения обработанных изображений. Добавьте каталог конечных результатов в интерфейс.
Установите средний параметр размера червя на уровне 2000, в текстовом поле Worm Size в интерфейсе. Установите порог перемещенного соотношения на уровне 0,93 в интерфейсе. Нажмите на кнопку Анализ, чтобы начать обработку изображений.
Разработанная программа позволяет распознавать червей и автоматически количественно давать количественную оценку фенотипам. В этом эксперименте, 33 различных особенностей были количественно для лечения хлорида кадмия в трех точках времени, ноль-час, 12 часов и 24 часов. Экспериментальные изображения показывают, что черви умирали быстрее по мере увеличения химической концентрации.
В начале не было существенной разницы между контролем и химической обработкой. После 12 часов лечения черви, обработанные высокой концентрацией, стали более прямыми и менее изогнутыми, чем при более низких концентрациях или в контрольных группах. Основная длина оси тела червя покрыты области увеличилось с увеличением времени.
Существует также градиентная тенденция от более низких до более высоких химических концентраций как в основной оси, так и в длине малой оси. Подвижность червей, основанная на области и соотношении, показала аналогичные закономерности. Поначалу существенной разницы не наблюдалось.
Со временем черви в контрольной группе показали стабильное снижение подвижности. Через 12 и 24 часа черви, которые лечились хлоридом кадмия, показали значительные различия в подвижности, по сравнению с контрольными группами. Кроме того, черви в условиях более высокой концентрации лечения показали слабую подвижность, по сравнению с червями при более низкой концентрации лечения.
Таким образом, этот метод прокладывает путь быстрой оценки токсичности в нескольких областях. Исследователи, которые могли бы применить этот метод к чрезвычайному анализу токсичности в пищевой токсикоз, оценка безопасности фармацевтических соединений, а также острый скрининг токсичности, и обнаружение новых химических веществ, и экологических экзогенных соединений. Хлорид кадмия является низкотоксичным веществом.
Пожалуйста, носите перчатки и маску во время обработки, и следуйте инструкциям по эксплуатации.
