C.elegans 독성 분석은 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 384웰 플레이트의 화학 물질로 C.elegans를 치료하고 비디오를 캡처하고 독성 관련 표현형을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 화학 물질의 잠재적인 급성 독성을 식별하고 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이러한 정량기술은 액체 배지를 가진 384웰 플레이트에서 12~24시간 화학처리 후 C.elegans의 33가지 파라미터를 자동으로 분석하기 위해 개발되었다. C.elegans는 새로운 화학 물질에 대한 신속한 독성 평가의 좋은 모델로 서 가치가 있다. 마우스로서, 식품 첨가제 오염, 제약 화합물, 환경 외인성 화합물 등으로 새로운 화학 물질의 독성 선별 및 테스트에 적용될 수 있다.
프로토콜을 주의 깊게 읽고 항상 단계별로 따라 가면 좋은 프로토콜이 될 것입니다. 시각적 데모는 사용자가 각 단계의 작동과 작업의 결과를 쉽게 볼 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 장원징장과 가오차오 한이 될 것이다.
그들은 내 실험실에서 대학원생입니다. 시작 하려면, 새로운 화학 물질에 대 한 예비 웜 치 사 율 테스트를 실시, 가장 높은 복용량을 결정 하기 위해, 그리고 가장 낮은 복용량, 100%치사율의 최소 농도, 그리고 100% 비 치사성. 이 실험을 위해, 염화물 카드뮴의 7 개의 그라데이션 농도를 준비합니다.
가장 높은 농축 수성 용액의 2배를 준비하려면 K 배지 8밀리리터로 채워진 원심분리기 튜브에 92.8밀리그램의 염화물 고체 분말을 녹입니다. 혼합 소용돌이. 분말이 완전히 용해된 후 파이펫을 사용하여 최대 10 밀리리터를 채웁니다.
K 배지로 희석하여 다른 농도 수준을 준비한다. 슈퍼 클린 벤치에서, 줄무늬 플레이트에서 E.coli OP50의 단일 식민지를 선택하고 식민지를 접종하기 위해 LB 국물의 100 밀리리터와 플라스크에 배치멸 균 팁을 사용합니다. 인큐베이터 셰이커에서 섭씨 37도에서 하룻밤 을 자랍니다.
NGM을 90밀리리터 플라스틱 페트리 플레이트에 붓습니다. 대장균 OP50 용액 300 마이크로리터로 각 플레이트를 시드합니다. 대부분의 웜이 성인 단계에 도달할 때까지 약 20도에서 3일 동안 OP50을 NGM 플레이트에 N2 웜을 배양합니다.
멸균물로 중력벌레를 15밀리리터 멸균 원심분리관으로 씻어 수확합니다. 벌레가 적어도 2 분 동안 정착하게하십시오. 물을 흡인하고 표백제 버퍼 5 밀리리터를 추가합니다.
튜브를 5분 동안 소용돌이게 한 다음 원심분리기에 튜브를 넣고 달걀을 펠릿하는 데 30초 동안 1300의 상대원심력으로 회전합니다. 파이펫을 사용하여 슈퍼나티를 흡인합니다. 튜브에 멸균 된 물 5 밀리리터를 추가하여 계란을 씻고 튜브를 5 초 동안 소용돌이시십시오.
1300의 상대 원심력에서 30 초 동안 튜브를 원심분리합니다. 상체를 제거하고 다시 세척하기 위해 살균 된 물의 5 밀리리터를 추가합니다. OP50이 있는 새로운 NGM 플레이트에 계란을 파이펫으로 피펫합니다.
하룻밤 사이에 섭씨 20도에서 배양하십시오. 다음 아침, 부화 된 벌레는 L1 단계에 도달합니다. 약 40시간 후에 웜이 L4 단계에 도달합니다.
K 배지를 사용하면 Petri 플레이트에서 L4 단원 벌레를 50밀리리터 멸균 원추형 튜브로 세척합니다. 파이프 50 마이크로 리터의 벌레 액체의 튜브에서 유리 슬라이드에. 스테레오 현미경하에서 파이펫을 사용하여 K 배지의 100 마이크로리터 당 약 40 마리의 동물로 웜의 농도를 조절합니다.
384웰 플레이트의 각 웰에 준비된 배지의 50 마이크로리터를 추가합니다. 이러한 동기화 된 L4 단계 벌레는 화학 물질에 의한 치료를 받을 준비가되어 있습니다. 화학 물질을 추가하기 전에 자동 스테이지에 동기화된 웜과 함께 384웰 플레이트를 배치하고 프로그래밍된 획득 프로시저를 사용하여 비디오 카메라를 설정합니다.
에서 384-잘 플레이트, 벌레는 각 개별 화학 물질의 6 ~ 7 복용량으로 처리 됩니다., 포함 하는 8 병렬 우물 50 모든 복용량에 대 한 두 번 화학 솔루션의 마이크로 리터. K배지의 8개의 평행웰중 적어도 3개의 그룹을 컨트롤로 준비한다. 각 웰에 대해 2배의 화학 용액50마이크로리터를 추가합니다.
시간을 0시간 지점으로 설정합니다. 그런 다음 384웰 플레이트를 섭씨 20도, 분당 80개의 회전으로 설정된 인큐베이터 셰이커에 넣습니다. 원하는 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 자동 단계로 옮김합니다.
12시간, 24시간 후, 벌레의 표현형을 확인하기 위해 접시의 각 우물의 비디오를 촬영합니다. 실험 비디오 처리를 시작하려면 비디오 파일을 컴퓨터로 전송합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 선택 버튼을 클릭하여 소스 이미지 디렉토리를 선택합니다.
중간 결과 디렉터리 추가합니다. 중간 결과에는 처리된 이미지의 시각적 관찰에 유용한 분할된 이미지가 포함됩니다. 인터페이스에 최종 결과 디렉터리추가합니다.
인터페이스의 웜 크기 텍스트 상자에 평균 웜 크기 매개 변수를 2, 000으로 설정합니다. 인터페이스에서 이동 비율의 임계값을 0.93으로 설정합니다. 분석 버튼을 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다.
개발된 프로그램은 웜을 인식하고 표현형을 자동으로 정량화할 수 있습니다. 본 실험에서, 33개의 뚜렷한 특징은 3개의 시간 지점에서 염화물 처리에 대해 정량화되었다, 제로 시간, 12 시간, 및 24 시간. 실험적인 이미지는 벌레가 화학 농도가 증가함에 따라 더 빨리 죽었다는 것을 보여줍니다.
처음에, 제어 및 화학 치료 사이 유의 한 차이가 없었다. 12시간의 치료 후, 고농도로 처리된 벌레는 낮은 농도 나 대조군보다 더 직선적이고 덜 곡선이 되었다. 웜 바디 커버 영역의 주요 축 길이는 시간이 증가함에 따라 증가했습니다.
또한 주요 축과 작은 축 길이 모두에서 낮은 화학 농도에서 더 높은 화학 농도까지그라데이션 추세가 있습니다. 면적과 비율에 따라 웜의 운동성은 유사한 패턴을 보였다. 처음에는 큰 차이가 관찰되지 않았습니다.
시간이 지남에 따라, 대조군내 의 벌레는 운동성에서 안정적인 감소를 보였다. 12 시간 및 24 시간 후에, 염화물 카드로 처리된 벌레는 대조군에 비해 운동성에 있는 중요한 다름을 보여주었습니다. 또한, 농도가 높은 치료법하에서 벌레는 낮은 농도 치료 하에 있는 벌레에 비해 연골이 약한 것으로 나타났다.
요약하자면, 이 기술은 여러 영역에서 급속한 독성 평가의 방법을 포장합니다. 식품 매개 독성의 독성의 비상 분석, 제약 화합물의 안전 평가, 급성 독성 스크리닝, 새로운 화학 물질의 검출 및 환경 외인성 화합물의 검출에 방법을 적용할 수 있는 연구원. 염화물 카드뮴은 독성이 낮은 물질입니다.
취급 하는 동안 장갑과 마스크를 착용 하 고 작동 지침을 따르십시오.
