C.elegans toksikolojik tsay değerlidir. Bu protokol, C.eleganların 384 kuyuluk bir plakadaki kimyasallarla nasıl tedavi edilebildiğini, video çekmeyi ve toksikolojik fenomeni nasıl ölçeceklerini açıklamaktadır. Bu yöntem, bir kimyasalın potansiyel akut toksisitesini belirlemeye ve tahmin etmeye yardımcı olabilir.
Bu kantitatif teknik, c.elegans'ın 33 parametresini sıvı ortamlı 384 kuyulu bir tabakta 12-24 saatlik kimyasal işlemden sonra otomatik olarak analiz etmek için geliştirilmiştir. C.elegans yeni kimyasallar için hızlı toksisite değerlendirme iyi bir model olarak değerlidir. Fareler olarak, toksisite tarama ve yeni kimyasalların test uygulanabilir, ya da gıda katkı maddesi kirliliği olarak bileşik, farmasötik bileşik, çevre eksojen bileşik, ve benzeri.
Protokolü dikkatle okuyun ve her zaman adım adım izleyin, o zaman iyi biri olacak. Görsel gösterim, kullanıcının her adımın çalışmasını ve işlemin sonucunu görmesi daha kolaydır. Prosedürü wenjing Zhang ve Gaochao Han gösterecektir.
Onlar benim laboratuvarımdan mezun öğrenciler. Başlamak için, yeni bir kimyasal için bir ön solucan öldürücülük testi yapmak, en yüksek doz belirlemek için, ve en düşük doz, hangi minimum konsantrasyon 100% öldürücü, ve maksimum konsantrasyon 100% ölümcül olmayan. Bu deney için, kadmiyum klorür yedi gradyan konsantrasyonları hazırlamak.
En yüksek konsantre sulu çözeltinin iki katını hazırlamak için, 8 mililitre K orta ile dolu bir santrifüj tüpünde 92,8 miligram kadmiyum klorür katı tozunu çözün. Girdap karıştırmak için. Toz tamamen çözüldükten sonra, 10 mililitreye kadar doldurmak için bir pipet kullanın.
K orta ile seyreltme ile diğer konsantrasyon düzeylerini hazırlayın. Süper temiz bir bankta, çizgi plakadan E.coli OP50 tek bir koloni almak için steril bir uç kullanın ve koloni aşılamak için LB suyu 100 mililitre ile şişe içine yerleştirin. Kuvöz çalkalayıcıda bir gecede 37 santigrat derecede büyütün.
90 mililitrelik plastik Petri plaka içine NGM dökün. Her plakayı 300 mikrolitre E.coli OP50 çözeltisi ile tohumlayın. 20 santigrat derecede 20 santigrat derecede OP50 ile NGM plakaları üzerinde kuluçka N2 solucanlar yaklaşık 2 ila 3 gün, solucanların çoğu yetişkin aşamasına ulaşana kadar.
Steril su ile, hasat için 15 mililitrelik steril konik santrifüj tüp içine gravid solucanlar aşağı yıkayın. Solucanlar en az 2 dakika sakinleşsin. Su aspire ve çamaşır suyu tampon beş mililitre ekleyin.
Beş dakika boyunca tüp girdap ve sonra yumurta pelet için 30 saniye boyunca 1300 göreceli bir santrifüj kuvvet te spin için bir santrifüj tüp koymak. Supernatant aspire etmek için bir pipet kullanın. Yumurtayıkamak için tüp içine sterilize su beş mililitre ekleyin ve beş saniye boyunca tüp girdap.
Tüpü 1300'lük göreceli bir santrifüj kuvvetinde 30 saniye santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve tekrar yıkamak için sterilize su beş mililitre ekleyin. Pipet OP50 ile yeni bir NGM plaka üzerine yumurta.
Bir gecede 20 derecede kuluçkaya yat. Ertesi sabah, yumurtadan çıkan solucanlar L1 aşamasına ulaşırlar. Yaklaşık 40 saat sonra solucanlar L4 aşamasına ulaşırlar.
K orta ile, Petri plakaları kapalı L4 sahne solucanları 50 mililitre steril konik tüp içine yıkayın. Pipet 50 mikrolitre solucan sıvısı tüpten cam bir slayta kadar. Stereo mikroskop altında, solucan ların konsantrasyonunu 100 mikrolitre K orta sına yaklaşık 40 hayvana ayarlamak için bir pipet kullanın.
384 kuyulu plakanın her kuyuya 50 mikrolitre hazırlanmış ortam ekleyin. Bu senkronize L4 evre solucanları kimyasallar tarafından tedavi edilmesi için hazırdır. Kimyasalları eklemeden önce, senkronize solucanlarla birlikte 384 kuyulu plakayı otomatik sahneye yerleştirin ve programlanmış satın alma prosedürüyle video kamera yı kedin.
384-iyi plaka, solucanlar her kimyasal altı ila yedi dozile tedavi edilir, sekiz paralel kuyular her doz için iki kez kimyasal çözelti 50 mikrolitre içeren. Kontrol olarak k orta sekiz paralel kuyulardan en az üç grup hazırlayın. Her kuyu için iki kez kimyasal çözelti 50 mikrolitre ekleyin.
Saati sıfır saat noktası olarak ayarlayın. Sonra, 384-iyi plaka kuvöz shaker 20 derece santigrat ve dakikada 80 devrimler ayarlayın. İstenilen bir süre sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve otomatik aşamaya aktarın.
12 saat ve 24 saat solucanların fenotiplerini kontrol etmek için plakanın her kuyunun videolarını çekin. Deneysel videoyu işlemeye başlamak için video dosyalarını bilgisayara aktarın. Grafik kullanıcı arabirimi aracılığıyla, kaynak görüntüler dizini seçmek için Seç düğmesini tıklatın.
Orta sonuç dizini ekleyin. Orta sonuçlar, işlenen görüntülerin görsel gözlemi için yararlı olan parçalı görüntüleri içerir. Arabirimdeki nihai sonuç dizini ekleyin.
Arabirimdeki Solucan Boyutu metin kutusunda ortalama solucan boyutu parametresini 2,000 olarak ayarlayın. Arabirimde taşınan oran eşiğini 0,93 olarak ayarlayın. Görüntü işlemeyi başlatmak için Analiz et düğmesini tıklatın.
Geliştirilen program solucanları tanıyabilir ve fenotipleri otomatik olarak ölçebilir. Bu deneyde, kadmiyum klorür tedavisi için üç saat, sıfır saat, 12 saat ve 24 saat olmak üzere 33 farklı özellik ölçüldü. Deneysel görüntüler, kimyasal konsantrasyon arttıkça solucanların daha hızlı öldüğünü gösteriyor.
Başlangıçta, kontrol ve kimyasal tedaviler arasında önemli bir fark yoktu. 12 saatlik tedaviden sonra, yüksek konsantrasyonla tedavi edilen solucanlar daha düşük konsantrasyonlarda veya kontrol gruplarına göre daha düz ve daha az kavisli hale geldi. Solucan gövdesinin ana eksen uzunluğu zaman arttıkça artmıştır.
Hem ana eksende hem de küçük eksen uzunluğunda daha düşükten daha yüksek kimyasal konsantrasyonlara doğru bir degrade eğilimi vardır. Solucanların hareketliliği, alana ve orana göre benzer desenler gösteriyordu. Başlangıçta anlamlı bir fark gözlenmedi.
Zaman geçtikçe, kontrol grubundaki solucanlar hareketlilikte istikrarlı bir azalma gösterdiler. 12 ve 24 saat sonra kadmiyum klorür ile tedavi edilen solucanlar kontrol gruplarına göre hareketlilikte önemli farklılıklar gösterdiler. Buna ek olarak, daha yüksek konsantrasyon tedavileri altında solucanlar daha zayıf bir hareketlilik gösterdi, düşük konsantrasyon tedavileri altında solucanlar ile karşılaştırıldığında.
Özetle, bu teknik birden fazla alanda hızlı toksisite değerlendirme bir yol açtır. Gıda kaynaklı toksisite nin acil analizine, farmasötik bileşiklerin güvenlik değerlendirmesine, akut toksisite taramasına, yeni kimyasalların tespitine ve çevresel eksojen bileşiklere bu yöntemi uygulayabilen araştırmacılar. Kadmiyum klorür düşük zehirli bir maddedir.
Lütfen kullanım sırasında eldiven ve maske giyin ve kullanım talimatlarına uyun.
