Ce protocole a présenté une méthode facile et fiable pour mesurer l’activité alcalinisée de phosphatase dans la culture de biofilm de S.aureus. Il nous aidera à comprendre la fonction d’ALP dans la formation de biofilms. Le principal avantage de cette technique est le débit élevé.
Il est très sensible et facile à exécuter. Kevin Danikowski, un ancien élève du Harper College, démontrera la procédure. Pour préparer le BST, ajouter le digest pancréatique de la caséine, la digestion papaique de la farine de soja, le chlorure de sodium, le dextrose et le phosphate de dipotassium dans l’eau distillée.
Couvrir le flacon de papier d’aluminium et le mettre dans un autoclave pour stériliser avant utilisation. Pour préparer une TSA, ajouter une agar au BST et la mettre dans l’autoclave pour la stérilisation. Ensuite, laissez-le refroidir à température ambiante.
Ensuite, versez-le dans la boîte de Pétri à un rapport de 20 millilitres par plat. Pour préparer un milieu de culture biofilm, ajouter du glucose au BST autoclavé pour atteindre la concentration de 10 grammes par litre. À l’aide d’un kit de filtration sous vide, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de la taille d’un pore de 0,2 micromètre.
Pour inoculer, utilisez une boucle d’inoculation stérilisée pour choisir une colonie individuelle de Staphylocoque dans la boîte de Pétri et la placer dans le tube de culture rempli de 10 millilitres de BST. Mettez le tube dans l’incubateur pour croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Avec une micropipette, dessiner 100 microlitres de la culture du jour au lendemain et le transférer dans un tube de culture rempli de 10 millilitres de BST avec du glucose pour une dilution de ratio de volume de 1:100.
Vortex doucement pour mélanger pour une concentration constante. Utilisez une micropipette pour transférer 200 microlitres de culture diluée dans un total de 18 puits à partir d’une plaque de puits de 96. Incuber la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour la formation de biofilms.
Pour la meilleure formation de biofilm de S.aureus, il est préférable de choisir une plaque de puits à fond plat ou rond 96. Après cela, inclinez légèrement la plaque pour décanter le surnatant par aspiration du bord de chaque puits. Lavez-les bien avec 1X PBS.
Mettez la plaque dans la centrifugeuse pour tourner pendant cinq minutes à 8000 tours par minute et décanter le supernatant par aspiration. Ajouter 75 microlitres de substrat ALP tamponné composé de PNPP disponible dans le commerce à chaque puits et utiliser une mise à jour pour enregistrer chaque point de temps en triplicate. Après chaque point de temps d’incubation, ajouter 75 microlitres de cinq hydroxyde de sodium molaire à chacun des trois puits pour arrêter la réaction.
Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 800 révolutions par minute. Utilisez une pipette pour transférer 100 microlitres de supernatant dans une nouvelle plaque de puits 96 pour la mesure calorimétrique. Utilisez un lecteur de plaques de puits de 96 puits pour mesurer l’absorption de chaque puits à 405 nanomètres.
Utilisez les puits de point de temps de 30 minutes pour contrôler le bruit de fond. Répétez l’expérience dans trois plaques de puits 96. Ce protocole développe un essai rapide et fiable pour mesurer l’activité d’ALP dans le biofilm de S.aureus qui ne nécessite pas l’isolement de protéine.
Le résultat représentatif de l’activité ALP montre une tendance accrue jusqu’à 75 minutes. Après 75 minutes, aucune augmentation de l’activité d’ALP n’a été observée. Il est très important d’établir une bonne culture biofilm et il peut prendre pas mal d’essais à maîtriser.
Vous pouvez confirmer la formation de biofilms en effectuant l’analyse de violette cristalline comme précédemment rapporté par nous et d’autres ou vous pouvez pré-traiter la plaque avec du plasma humain pour faciliter la formation de biofilms. Après son développement, vous pouvez dépister les inhibiteurs potentiels de l’ALP qui pourraient interférer avec la formation de biofilms. Le résultat fournira des informations importantes sur la gestion des biofilms dans le domaine médical.
Cinq hydroxyde de sodium molaire peuvent être dangereux en cas de contact. Assurez-vous de porter de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation.
