Cette méthode permet aux chercheurs de sonder systématiquement comment les indices de matrice affectent le phénotype des cellules en culture 3D. Nous démontrons la procédure en utilisant des cultures de cellules GBM. Le principal avantage de cette technique est la mise en œuvre à haut débit, qui nous permet de filtrer de nombreuses conditions matricielles.
Cette technique peut être utilisée pour développer des matrices tissulaires-mimétiques qui préservent des fonctions spécifiques dans des modèles de culture cellulaire, comme la résistance aux médicaments des cellules tumorales, et potentiellement identifier de nouveaux traitements. Mary Epperson et Kelly Tamura, chercheuses de premier cycle du laboratoire Seidlits, feront la démonstration de la procédure. Commencez par préparer une solution tamponnée HEPES en dissolvant la poudre HEPES à 20 millimolaires dans une solution saline équilibrée hanks.
Ajuster le pH à sept après une sorbation complète. Dans la solution tamponnée HEPES, dissoudre l’HA thiolé de sorte que 6 à 8% des résidus d’acide carboxylique sur chaque acide glucuronique soient modifiés avec un thiol à une concentration de 10 milligrammes par millilitre dans une solution tampon. Remuer à moins de 1 000 rotations par minute à l’aide d’une plaque magnétique à température ambiante jusqu’à dissolution complète, généralement environ 45 minutes.
Pendant la dissolution de l’AH, préparez des solutions séparées de 100 milligrammes par millilitre de 8 bras de PEG norbornène à 8 bras, de 100 milligrammes par millilitre de thiol PEG à 4 bras, de quatre millimolaires de cystéine ou de peptide contenant de la cystéine et de quatre milligrammes par millilitre de LAP dans des tubes de microcentrifugation. Préparez des solutions de quatre millimolaires de tous les peptides à attacher dans un seul hydrogel à ce stade. Mélanger les solutions individuelles de HA, PEG norbornène, PEG thiol et peptides contenant de la cystéine-thiol pour obtenir les concentrations finales pour les matrices finales d’hydrogel.
Remuer à moins de 1 000 rotations par minute sur une plaque d’escalier magnétique pendant au moins 30 minutes pour mélanger complètement. Alignez les échantillons avec le dispositif d’éclairage avec toutes les autres LED dans une seule colonne des moules en silicone ou de la plaque à 384 puits. Ouvrez paramètres LED UV et entrez les valeurs d’intensité et d’éclairage.
Cliquez ensuite sur Terminer pour commencer l’éclairage. Après l’éclairage, lorsqu’il est placé dans un coin, déplacez la plaque de puits vers le coin suivant et répétez. Pour éclairer les puits sur l’autre moitié de la plaque, soulevez la plaque hors du support et faites pivoter de 180 degrés.
Pour générer des hydrogels avec des mécaniques variables, commencez par nettoyer les lames de verre et les moules en silicone à l’aide de ruban adhésif pour éliminer les débris. Collez les moules en silicone à la glissière en verre, appuyez vers le bas pour assurer une bonne étanchéité et déplacez les bulles d’air. Ensuite, pipettez 80 microlitres de solution de précurseur d’hydrogel dans chaque moule en silicone sur la lame de verre.
Placez la glissière en verre sur le dispositif d’éclairage aligné avec toutes les autres LED dans une seule colonne. Exposez les précurseurs de l’hydrogel à la lumière UV pendant 15 secondes pour créer une réticulation photo. Une fois l’éclairage arrêté, récupérez les lames et desserrez les gels des moules en traçant la circonférence interne du moule avec une pointe fine.
Retirez les moules en silicone avec une pince à épiler ou une pince. Remplissez une plaque de 12 puits avec deux millilitres de DPBS. Déplacez les hydrogels réticulés dans une plaque de puits individuelle en mouillant une spatule et en les poussant doucement hors de la glissière de verre.
Préparez les cellules souhaitées sous forme de solution unicellulaire. Recueillir les sphéroïdes du glioblastome, d’environ 150 micromètres de diamètre, d’une culture en suspension de flacon T-75 dans un tube conique de 15 millilitres. Rincez la fiole de culture avec cinq millilitres de DPBS pour éliminer les cellules et les milieux résiduels et ajoutez ce volume au tube conique.
Centrifuger le tube conique contenant les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire et remettre en suspension dans cinq millilitres de DPBS. Centrifuger à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante pour laver les cellules.
Aspirer le surnageant avec une pipette sérologique de cinq millilitres, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire, puis remettre en suspension les cellules dans deux millilitres de réactif de dissociation cellulaire. Incuber à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Ajouter trois millilitres de milieu complet et pipeter doucement trois à cinq fois pour décomposer les sphéroïdes en une suspension à cellule unique.
Centrifuger la suspension monocellulaire à 400 fois G pendant cinq minutes pour les granuler à température ambiante. Aspirer le surnageant avec une pipette sérologique de cinq millilitres, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans un millilitre de milieu complet.
Retirez une partie des cellules pour le comptage à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer cette portion deux fois avec du bleu de trypan, qui imprègne les cellules avec une viabilité compromise. Ne comptez que les cellules vivantes et incolores.
Déterminez le nombre de cellules nécessaires à l’encapsulation. Transférer un volume de milieu contenant le nombre total de cellules nécessaires dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,7 millilitre. Tourner vers le bas à 400 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.
Aspirer le surnageant avec une micropipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettre en suspension la pastille de cellule dans la solution de précurseur d’hydrogel, en mélangeant bien en pipetant de haut en bas avec une micropipette de 1 000 microlitres quatre à cinq fois. Chargez les cellules dans un pipetter répétitif réglé pour distribuer 10 microlitres.
Pour éviter les bulles et la distribution inégale, amorcez la pipetter répétitive en distribuant une à deux fois supplémentaire dans un conteneur à déchets. Dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, distribuer 10 microlitres de cellules en suspension dans une solution d’hydrogel du pipetter répétitif. À l’aide du réseau de LED, éclairez chaque cellule contenant un puits pendant 15 secondes pour obtenir les propriétés mécaniques souhaitées.
Ajouter 40 microlitres de milieu complet à chaque puits contenant les cellules. Ajouter 50 microlitres de DPBS aux puits secs non expérimentaux entourant les gels pour minimiser les pertes dues à l’évaporation. Pour les cellules de glioblastome, ajouter 40 microlitres du médicament contenant le milieu pour atteindre la concentration finale souhaitée, en commençant trois jours après l’encapsulation.
Ajouter 10 microlitres de réactif CCK8 à chaque puits contenant les cellules. Incuber pendant une à quatre heures, selon les instructions du fabricant. Lire les absorbances à 450 nanomètres pour tous les puits après l’incubation.
L’interrogation par l’AFM de régions à l’échelle du micron à la surface d’hydrogels simples a montré que les hydrogels avec des modules de Young moyens plus mous avaient également des gammes de modules plus petites que les hydrogels plus rigides. Les cultures 3D de cellules GS122 ensemencées à des densités de 2 500 000 cellules par millilitre ont montré des viabilités considérablement plus élevées lorsqu’elles ont été évaluées après sept jours en culture par rapport à celles ensemencées à des densités de 500 000 cellules par millilitre. Les cellules GS122 ont montré des gains de survie dans la condition de huit kilopascal lorsque les peptides dérivés de l’ostéopontine ont été inclus dans la matrice, tandis que l’incorporation de sialoprotéines liant l’intégrine ou de peptides dérivés de la ténascine C a fourni des avantages de survie minimes, tels que la culture et les matrices avec le peptide RGD de gingembre.
En revanche, aucun peptide n’a conféré des gains de survie dans la condition de culture de 0,8 kilopascal. Les cellules GS122 et GS304 se propagent lorsqu’elles sont cultivées dans des matrices d’hydrogel souples ou rigides, y compris des peptides contenant du RGD. Les cellules GS122 montrent un manque similaire de propagation dans les 0,8 et 8 kilopascals avec l’ostéopontine.
Cependant, GS122 n’a montré une résistance accrue au témozolomide que dans la condition de huit kilopascals. Enfin, cette plateforme de culture 3D miniaturisée peut être utilisée pour cultiver des cellules humaines d’autres types de tumeurs, y compris des organoïdes viables de cellules neuroendocrines cancéreuses de la prostate différenciées en phase terminale. Après cette procédure, d’autres techniques telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire peuvent être utilisées pour caractériser davantage les phénotypes cellulaires.
