Nous tenons à remercier V. Zimmermann pour l&#39;assistance technique excellente et pour les soins de poissons. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la science, numéro d&#39;obtention: 310000_120611.

1. Equipement Set-up <ol><li> Le principal outil utilisé pour effectuer cryoinjury est la cryosonde, l&#39;instrument en forme de stylo qui est faite d&#39;acier inoxydable (figure 1A). La poignée cylindrique est de 40 mm de long et a un diamètre de 8 mm. La pointe de l&#39;applicateur est de 6 mm de long et 0,8 mm de diamètre. La jonction entre la pointe et la poignée est conique 4 mm de long. En outre, la poignée de la sonde cryogénique doit être isolé avec un tube en plastique et du ruban adhésif pour éviter les engelures des doigts tout en maintenant l&#39;outil lors de la procédure. </li><li> D&#39;autres matériaux qui sont nécessaires pour la cryochirurgie sont un stéréomicroscope, pince tranchants, ciseaux à ressort micro dissection et d&#39;une pipette de transfert en plastique. En outre préparer un bécher d&#39;anesthésier le poisson et une cuillère en plastique pour le transfert des poissons. </li><li> Pendant la chirurgie, les poissons sont placés sur une éponge humide avec sa place face ventrale (figure 1B). Pour tenir l&#39;animal dans une procédure stable, unerainure appropriée devrait être coupées manuellement dans l&#39;éponge. </li><li> Préparer un réservoir avec de l&#39;eau du système de transférer le poisson après la chirurgie. </li><li> Mettre en place un timer premier double avec un compte à rebours 10 secondes et ensuite automatiquement un compte à rebours 24 secondes. </li></ol> 2. La procédure Cryoinjury <ol><li> Refroidir la cryosonde par immersion de la pointe dans 3-5 cm de l&#39;azote liquide pendant au moins 3 min. </li><li> Anesthésier une poisson-zèbre adulte par elle immerger dans 0,02% tricaïne jusqu&#39;à ce que le poisson tourne sur son dos et ses branchies presque arrêter de bouger (environ 90 secondes). </li><li> Transférer le poisson avec une cuillère en plastique pour une éponge humide qui a été coupé de tenir un poisson à l&#39;envers (figure 1B). Tenez le poisson régulière avec une pince à l&#39;aide la main non dominante. Localiser visuellement la marge postérieure médiane du cœur et d&#39;utiliser des ciseaux iridectomie droits pour perforer la peau. (Figure 1C). </li><li> Faire un petit (env. 2 mm) incision au-dessus du coeur par cutting droite vers l&#39;avant à travers la peau, les muscles (figure 1D). Ne pas couper à travers l&#39;appareil osseux branchiale, car cela va tuer l&#39;animal. </li><li> Doucement déchirer la couche argentée épithéliale de l&#39;hypoderme (figure 1E) avec la pointe des ciseaux pour avoir un accès direct au ventricule battant. Ne pas insérer les ciseaux plus profondément dans la cavité du corps, que cette ponction la volonté du cœur. Le cœur battant doit être bien visible, et aucun saignement de grande envergure devrait se produire au cours de la thoracotomie (figure 1F). </li><li> Démarrer la minuterie programmée qui a été fixé à 10 secondes, suivi par 24 secondes. Pendant 10 secondes retirer la sonde cryogénique de l&#39;azote liquide. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas plus d&#39;azote sur la cryosonde en le secouant doucement. Fais l&#39;incision latéralement en utilisant une pince pour ouvrir le coffre (figure 1F). </li><li> Une fois que le minuteur sonne 10 secondes, toucher immédiatement, mais doucement le ventricule avec la pointe de la pre-refroidi cryosonde (Figure 1G). </li><li> Une fois que le minuteur sonne 24 secondes, versez 2-3 ml d&#39;eau du système à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique sur la poitrine pour libérer le cryosonde à partir de tissus, et de transférer le poisson dans le réservoir avec de l&#39;eau du système. </li><li> Le poisson doit relancer la respiration après quelques secondes, puis il devrait reprendre la natation. Si elle ne respire pas, après environ 45 secondes, à stimuler l&#39;animal en injectant de l&#39;eau dans les branchies avec une pipette en plastique jusqu&#39;à ce qu&#39;il commence à respirer par lui-même. Dans notre expérience, 95% des poissons survivent la chirurgie, et tous les décès se produisent le jour de la chirurgie. Il ne sera pas nécessaire de suturer les incisions. </li></ol> 3. Collection Coeur et la fixation des <ol><li> Préparer 1 ml de formol à 2% dans un microtube pour la fixation du cœur, deux pinces, micro-dissection des ciseaux et l &#39;éponge humide fendue. </li><li> À la date choisie après cryoinjury, euthanasier les poissons dans 0,1% tricaïne pendant 5 minutes. </li><li> Placez lepoissons face ventrale vers le haut dans un sol humide, une éponge fendue. Faire une grande (environ 4 mm) incision au-dessus du cœur à travers le cartilage branchial avec les ciseaux micro dissection. Ouvrez largement l&#39;incision avec une pince (Figure 1H). </li><li> Pincez le bulbe artériel, une structure blanche antérieure au ventricule (figure 1 HI), et retirer le coeur de la cavité en le tirant. Un cœur tout entier disséqué est montré dans la figure 1J et la figure 2A. </li><li> Placez un maximum de 3 coeurs dans un microtube avec 1 ml de formol à 2%. Tournez doucement le tube à plusieurs reprises et le garder une nuit à 4 ° C. </li></ol> 4. Coeur de montage <ol><li> Rincer les cœurs dans du PBS pendant 5 minutes. Transfert des coeurs dans 10 ml de saccharose à 30% qui devrait être pré-refroidi à 4 ° C, et mélanger doucement. L&#39;échantillon doit d&#39;abord flotter à la surface de la solution de saccharose. Continuer d&#39;incubation de 1 heure 20 minutes à 4 ° C. Aprèscette fois, les cœurs vont tomber au fond du tube. </li><li> Préparer une boîte avec de la glace sèche. Prendre un moule enrobage, et verser une couche de 5 mm de milieu de montage octobre au fond du moule. </li><li> Avec des pinces placer le coeur dans le T OC milieu de montage dans le moule. Au microscope stéréoscopique, ajuster l&#39;orientation de l&#39;échantillon pour atteindre le sommet ventriculaire sur le fond du moule, et le bulbe artériel vers le haut. </li><li> Placez les moules avec le spécimen sur glace sèche. Lorsque le milieu de montage commence à geler, remplir le reste du moule avec le milieu PTOM et le laisser geler complètement. Maintenir le moule pendant au moins 1 h à 80 ° C avant la coupe. Le spécimen congelé peut être conservé pendant plusieurs mois à -80 ° C. </li></ol> 5. Coeurs de sectionnement <ol><li> Mettre en place un cryostat avec une taille de coupe de 16 um, une température de la chambre de -24 ° C et la température de l&#39;échantillon à -22 ° C. </li><li> Placez le bloc congelé à laspécimen dans le cryostat et fixer l&#39;orientation de commencer la coupe parallèle au fond du bloc. </li><li> Préparer six Superfrost-plus lames par un bloc et les numerate 1 à 6. Commencer à couper le tissu jusqu&#39;à ce soit atteinte, et couper le bloc autour de l&#39;échantillon avec une lame de rasoir. </li><li> Pour obtenir 6 répétitions d&#39;un seul cœur, prendre la première section de la diapositive 1, la deuxième section sur la diapositive 2, le troisième sur la diapositive 3, etc Une fois que vous avez placé la sixième section de la diapositive 6, redémarrer avec la diapositive 1 et continuer jusqu&#39;à ce que le organe entier est coupé. Recueillir des deux rangées de près 8 articles sur le coulisseau (figure 3). </li><li> Laissez-les diapositives sec pendant 1 heure à température ambiante. Conservez-les pour un maximum de 1 an dans des boîtes hermétiquement fermées à -20 ° C. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Représentant un accident cardiaque à la suite de ce protocole est indiqué dans disséqués coeurs entiers à 4 dpci (cryoinjury jours après; figure 2D-F). Pour visualize le tissu du myocarde in vivo, on utilise du poisson transgénique exprimant la EGFP et DsRed2 nucléaire sous le contrôle d&#39;spécifiquement cardiaque CAGC-2 promoteur 11,12. L&#39;absence de EGFP et DsRed2 signaux fluorescents délimité une zone de l&#39;infarctus en forme de disque le long de la paroi ventriculaire apicale-latérale. Pour effectuer des analyses cellulaires et moléculaires du tissu, les cœurs étaient fixes et sectionné avec un cryostat. Une diapositive représentant avec une série consécutive de sections transversales de coeur est illustré à la figure 3. Les sections peuvent être analysées par des méthodes différentes (figure 4). Pour déterminer l&#39;étendue de la régénération cardiaque par rapport à la cicatrisation, nous avons effectué une analyse histologique en utilisant fuchsine acide Orange-G (AFOG) coloration, qui marque de manière différentielle les tissus cardiaques et de fibrose 9. Les analyses d&#39;expression génique ont été réalisés conformément à la procédure en hybridation in situ <sup&gt; 13. Pour détecter la distribution des protéines marqueurs, nous avons appliqué immunofluorescence avec des anticorps spécifiques 9. Une combinaison de procédures de coloration diverses conduit à l&#39;identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la régénération suivante cryoinjury cardiaque. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> Figure 1. Induire cryoinjury du ventricule chez le poisson zèbre adulte. (A) Une photographie de la cryosonde. (B) Un poisson-zèbre adulte est placé dans la fente de l&#39;éponge avec son côté ventral vers le haut. Incision thoracique (FC) pour accéder au cœur. (C) Une petite incision à travers la peau et les muscles est faite entre les deux nageoires pectorales (ligne rouge). (D) Les ciseaux sont insérés dans l&#39;incision pour couper la peau suivant la flèche rouge. (E) sous la peau, la fine couche de l&#39;hypoderme argentée (encerclée par la ligne pointillée bleue) est légèrement ouvert pour accéder au cœur. (F) L&#39;incision est répartie avec lepince et le ventricule battant (flèche verte) est accessible pour cryoinjury. (G) La cryosonde froid est délicatement inséré dans la poitrine pour toucher le cœur. Collecte de coeur (HJ). (H) Une incision profonde et longue est faite à travers les arcs branchiaux de la poitrine pour accéder à la cavité péricardique. Deux structures cardiaques sont visibles: bulbe artériel (flèche blanche) et le ventricule (flèche verte). (I) Le bulbe artériel est de tenir avec une pince et tiré hors de la cavité du corps. (J) La coeur entier est excisé à partir du corps. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> Figure 2. De contrôle représentant et les cœurs cryoinjured disséqués à partir poisson-zèbre transgénique exprimant la EGFP et adultes DsRed2 nucléaire dans les cardiomyocytes. (AC) indemne coeur. (A) L&#39;éclairage en champ sombre montre le ventricule (V), bulbe artériel (Ba, blanc) et les soupapes (Va), où l&#39;atrium a été liée au ventricule. (B et C) des images fluorescentes de t<html> il intacte EGFP affichage ventricule et DsRed2 expression dans les cardiomyocytes. (DF) Coeur à 4 jours après cryoinjury (4 dpci) (D) L&#39;éclairage en champ sombre révèle un infarctus en forme de disque (ligne jaune discontinue). (EF) des cardiomyocytes marqueurs EGFP et DsRed2 ne sont pas détectées dans la zone du myocarde, indiquant l&#39;endommagé myocarde (entouré par la ligne en pointillés). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> Figure 3. Sectionnement du cœur. (A) de tout cœur avec le dessin de sections transversales à partir du bas du coeur (1 et 2, en rouge) vers le haut du cœur (3 et 4 en vert). (B) Photographie d&#39;une lame avec la série de sections transversales consécutives colorées avec AFOG (fuchsine acide Orange-G). Les premières sections (1 et 2, carrés rouges) contiennent de l&#39;apex du ventricule, et les dernières sections du cœur (3 et 4, des carrés verts) comprennent bulbe artériel. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; Exemples Figure 4. De l&#39;analyse effectuée sur des sections de coeur à 7 jours après cryoinjury. (A) AFOG (fuchsine acide Orange-G) des étiquettes de coloration des cellules musculaires saines en orange, le tissu cicatriciel contenant du collagène en bleu et en rouge la fibrine. (B) L&#39;hybridation in situ de la chaîne lourde de myosine ventriculaire (vmhc) ARNm visualise l&#39;état intact du myocarde (coloration au bleu). Le tissu lésé est dépourvue de la transcription génique cardiaque (rouge pointillé). (C) Immunoassaying de la tropomyosine (vert) qualifie cardiomyocytes intacts et non des tissus endommagés (encerclée avec la ligne pointillée). DAPI (bleu) taches les noyaux de toutes les cellules. (D) cardiomyocytes génétiquement marqués expresse DsRed2 (rouge) dans leurs noyaux. DAPI (bleu) qualifie tous les noyaux. La zone d&#39;infarctus ne contient pas de cellules positives DsRed2 (ligne blanche pointillée).

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	<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+of+newt:+a+recipe+for+regeneration.">Heart of newt: a recipe for regeneration.</a> J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Ausoni, S., Sartore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fish+to+amphibians+to+mammals:+in+search+of+novel+strategies+to+optimize+cardiac+regeneration.">From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration.</a> J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).</li><li>Borchardt, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+regeneration+in+non-mammalian+model+systems:+what+are+the+differences+between+newts+and+man.">Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man.</a> Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).</li><li>Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).</li><li>van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury:+a+model+of+myocardial+regeneration.">Cryoinjury: a model of myocardial regeneration.</a> Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptin+and+pontin+antagonistically+regulate+heart+growth+in+zebrafish+embryos.">Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos.</a> Cell. 111, 661-672 (2002).</li><li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate.">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+signaling+between+blastema+and+wound+epidermis+is+required+for+fin+regeneration.">IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration.</a> Development. 137, 871-879 (2010).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).</li><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease:+mechanisms+and+significance.">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).</li></ol>

La recherche expérimentale sur les animaux a été approuvé par le bureau de vétérinaire cantonal de Fribourg.

Cryoinjury est défini comme le dommage contrôlée de tissu par l&#39;application précise de 14 froid. Direct choc thermique détruit les cellules par la destruction des protéines et par la formation de glace intracellulaire de cristal liquide qui rompt la membrane plasmique. Par conséquent, les cellules lésées meurent dans les processus de l&#39;apoptose et la nécrose 14. Ces deux mécanismes de mort cellulaire a été démontré que de contribuer à la perte de tissu après un infarctus du myocarde 15. Ainsi, cryoinjury représente un modèle approprié d&#39;induire un infarctus cardiaque. Plusieurs études ont rapporté cette méthode bien prouvé dans divers mammifères, y compris les souris, rats, lapins et porcs 6,7. L&#39;adaptation du protocole cryoinjury chez le poisson zèbre permet une discussion plus comparative sur la réponse du myocarde entre les différentes espèces. Deux autres groupes développés de façon indépendante la procédure cryoinjury pour le cœur du poisson zèbre adulte. Les principales différences sont la surméthodes chirurgie, le type d&#39;outils et appliquée temps de congélation. Dans l&#39;étude de González-Rosa et al., Le péricarde a été ouverte par la déchirure du tissu au lieu de couper. Ils ont utilisé 0,3 mm filament de cuivre relié à un tube de polyamide pré-refroidi dans l&#39;azote liquide pour geler le cœur pendant quelques secondes jusqu&#39;à ce que le dégel a pu être observée 10. Dans l&#39;étude de Schnabel et al., Une pièce conique de la glace sèche de 20 mm de longueur avec une pointe de 2 mm dans son diamètre a été utilisé pour toucher le cœur pendant 10 secondes 8. Les deux groupes obtenu dommages ventriculaire par la mort du myocarde. L&#39;avantage de notre méthode est un dépôt plus reproductible de riche en collagène cicatriciel, qui imite mieux les premières réponses de guérison infarctus observés dans les systèmes mammaliens. L&#39;étape critique lors de la procédure cryoinjury chez le poisson zèbre est une incision à travers la peau et le péricarde sans perforer le coeur sous-jacente. Un correctement performela chirurgie d provoque des saignements peu. Saignement abondant indique une ponction accidentelle du ventricule avec des ciseaux. Dans de tels cas, les animaux doivent être rentrés de l&#39;expérience. Pour éviter de percer le cœur, le point de ciseaux doit être destiné à un angle faible de la peau. Un autre aspect important pour la création d&#39;une blessure reproductible est le positionnement exact de la cryosonde froid sur le ventricule pendant la durée optimale précise. Trop court temps de congélation se traduira par une inflammation à la mort cellulaire peu. Congélation prolongée, d&#39;autre part, peut causer des dommages importants du cœur, ce qui peut conduire à une mortalité accrue des animaux. Nous avons déterminé que le meilleur moment pour tenir le ventricule dans les gammes de l&#39;état congelé entre 23-26 secondes pour un 2 cm de long poisson zébré adulte, et peuvent donc différer dépendamment de la taille des animaux. Parce que notre protocole est très simple et rapide, il n&#39;ya pas de limite expérimentaletions à soumettre un nombre suffisant d&#39;animaux pour obtenir des réplications biologiques adéquats. Le traitement de cryochirurgie est très bien tolérée par les animaux. Collection des cœurs à différents moments après cryoinjury permet la caractérisation détaillée des phases ultérieures au cours du processus de régénération. L&#39;analyse expérimentale des coeurs cryoinjured peut comprendre 1) visualisation de la transcription des gènes par hybridation in situ, 2) la détection de la distribution des protéines par immunofluorescence, 3) l&#39;imagerie histologique des structures différentes. Comprendre les processus de guérison clés après un infarctus du myocarde chez le poisson zèbre aura un impact sur le domaine de la biologie régénérative. En outre, il pourrait être bénéfique pour la conception de nouvelles approches thérapeutiques en médecine régénérative.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Micro ciseaux de dissection de printemps </td><td> Roboz chirurgical Instrument Co., Inc </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaïne </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Formaldéhyde ~ 36% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek composé OCT </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Diapositives Superfrost Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way Moules incorporation jetables - moules tronqués T8 </td><td> Polyscience, Inc </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

Le coeur de mammifère est incapable de régénération importante suite à une blessure aiguë comme un infarctus du myocarde 1. En revanche, les amphibiens urodèles et les poissons téléostéens conserver une capacité remarquable pour la régénération cardiaque avec peu ou pas de cicatrices long de la vie 2,3. On ne sait pas pourquoi seuls certains vertébrés non mammifères peuvent recréer un organe complet, à partir de tissus résiduels 4,5. Pour comprendre les différences moléculaires et cellulaires entre des réactions de régénération des espèces différentes, nous avons besoin d&#39;utiliser des approches similaires pour induire les lésions aiguës. Chez les mammifères, le modèle le plus fréquemment utilisé pour étudier la réparation cardiaque a été une ischémie aiguë après une ligature de l&#39;artère coronaire ou la destruction des tissus après cryoinjury 6,7. La régénération cardiaque chez les tritons et de poisson-zèbre a été principalement étudiée après une résection partielle de l&#39;apex du ventricule 2,3. Récemment, plusieurs groupes ont établished la technique cryoinjury à 8-10 poisson zèbre adulte. Cette méthode a un grand potentiel, car elle permet une discussion comparative des résultats obtenus à partir des espèces de mammifères et non mammifères. Ici, nous présentons une méthode pour induire une reproductible en forme de disque infarctus du ventricule poisson zèbre par cryoinjury. Ce modèle est basé sur des blessures rapide de congélation-décongélation des tissus, ce qui entraîne une mort cellulaire massive d&#39;environ 20% des cardiomyocytes de la paroi ventriculaire. Tout d&#39;abord, une petite incision a été faite à travers la poitrine avec des ciseaux iridectomie pour accéder au cœur. La paroi ventriculaire a été directement congelé en appliquant des 23-25 ​​secondes, un cryosonde acier inoxydable prérefroidi dans l&#39;azote liquide. Pour arrêter la congélation de l&#39;eau du poisson cœur, à la température ambiante a été larguée sur la pointe de la sonde cryogénique. La procédure est bien tolérée par les animaux, avec un taux de survie de 95%. Afin de caractériser le processus de régénération, les cœurs étaientprélevés et fixés à des jours différents après cryoinjury. Par la suite, l&#39;échantillon ont été embarqués pour cryosectioning. Les diapositives avec des sections ont été traitées pour l&#39;analyse histologique, l&#39;hybridation in situ et d&#39;immunofluorescence. Cet engagement renforce notre compréhension des facteurs qui sont nécessaires pour la plasticité de régénération chez le poisson zèbre, et de fournir de nouveaux aperçus sur les mécanismes de la régénération cardiaque. Une compréhension conceptuelle et moléculaire de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre aura un impact à la fois la biologie du développement et de la médecine régénérative.

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Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Le poisson zèbre représente un précieux modèle pour étudier les mécanismes de la régénération cardiaque chez les vertébrés. Ici, nous présentons un protocole pour l&#39;induction d&#39;un infarctus cardiaque chez le poisson zèbre adulte en utilisant cryoinjury. Cette méthode aboutit à une mort cellulaire massive au sein de 20% de la paroi ventriculaire, similaire à celle observée dans les infarctus de mammifères.

L&#39;induction de l&#39;infarctus du myocarde chez le poisson zèbre Adulte utilisant Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

22.0K vues.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. Le poisson zèbre représente un précieux modèle pour étudier les mécanismes de la régénération cardiaque chez les vertébrés. Ici, nous présentons un protocole pour l'induction d'un infarctus cardiaque chez le poisson zèbre adulte en utilisant cryoinjury. Cette méthode aboutit à une mort cellulaire massive au sein de 20% de la paroi ventriculaire, similaire à celle observée dans les infarctus de mammifères.

Vidéo: Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarctus aigu du myocarde chez le rat

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Recherche

Médecine

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

IRM et la TEP dans les modèles de souris de l&#39;infarctus du myocarde

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Infarctus du myocarde et d&#39;évaluation fonctionnelle de résultats chez le porc

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal intervention chirurgicale invasive d&#39;induire un infarctus du myocarde chez des souris

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Évaluation des résultats primaires dans un modèle porcin de infarctus aigu du myocarde

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarctus du myocarde chez les souris néonatales, Un modèle de régénération cardiaque

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Analyse en temps réel la pression-volume de l’infarctus aigu du myocarde chez la souris

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modèle d'infarctus myocarde de Murine utilisant la ligation permanente de l'artère coronaire descendante antérieure gauche

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modèle cryo-blessure pour étudier l'infarctus du myocarde chez la souris

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI remodeling and evaluation of novel therapeutics. Different methods (e.g., isoproterenol treatment, cryoinjury, coronary artery ligation, etc.) have been used to induce MI. Compared with isoproterenol treatment and cryoinjury, coronary artery ligation may better reflect the ischemic response and chronic remodeling after MI. However, traditional methods for coronary ligation in mice are technically challenging. The current study describes a simple and efficient process for induction of MI in mice with readily available materials. The mouse chest skin was cut open under stable anesthesia. The heart was immediately externalized through the intercostal space after blunt separation of the pectoralis major and pectoralis minor. The left anterior descending branch (LAD) was ligated with a 6-0 suture 3 mm from its origin. Following LAD ligation, staining with 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) indicated successful induction of MI and temporal changes of post-MI scar size. Meanwhile, survival analysis results showed overt mortality within 7 days after MI, mainly due to cardiac rupture. Moreover, post-MI echocardiographic assessment demonstrated successful induction of contractile dysfunction and ventricular remodeling. Once mastered, an MI model can be established in mice within 2-3 min with readily available materials.

Under adequate anesthesia, the mouse heart was externalized through the intercostal space, and myocardial infarction was successfully induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using materials readily available in most laboratories.

Méthode simple modifiée pour l’induction d’un infarctus du myocarde chez la souris

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...