Le suivi 3D d’une molécule unique peut déterminer les localisations subcellulaires et les comportements de mouvement des protéines individuelles. L’observation du mouvement d’une protéine dans une cellule vivante fournit des informations importantes sur son interaction avec les partenaires liants dans son environnement naturel. La méthode présentée ici fournit un cadre général pour l’analyse des données de suivi d’une molécule unique pour résoudre les états diffusifs des molécules biologiques.
Il peut être appliqué à la fois sur les trajectoires 2D et 3D qui sont confinées à des volumes cellulaires de forme arbitraire. Après avoir déposé la perle fluorescente dans un tampon d’agarose pré-préparé tel que décrit dans le protocole de texte qui l’accompagne, placez-le sur un glissement de couverture de microscope et fixez le bordereau de couverture au porte-échantillon de microscope. Le porte-échantillon est ensuite monté sur un microscope à fluorescence inversé.
Ensuite, initialisez l’interface utilisateur graphique du microscope;ici, un logiciel écrit sur mesure dans MATLAB est utilisé pour le contrôle des instruments. Initialisez le logiciel de caméra HCImage Live. Dans l’onglet Capture sous la section Contrôle de la caméra, réglez le temps d’exposition à 0,03 seconde, puis cliquez sur Live pour commencer un flux en direct de la caméra.
Cliquez sur le bouton Laser ouvert approprié sur l’interface GUI pour débloquer le laser et exciter les perles fluorescentes sur le pad agarose. Affichez l’émission de fluorescence sur la caméra en mode live-stream. Ajustez les positions X et Y de l’étape microscope en cliquant sur les flèches XY-Position sous la section Étape de micro-positionnement de l’interface utilisateur pour positionner au moins une perle fluorescente au centre du champ de vision.
Si nécessaire, modifiez la taille de l’étape en cliquant sur la boîte de dropdown sous les flèches. Ajustez ensuite la position Z de l’étape microscope en cliquant sur les flèches Z-Position sous la section Nano-Positioning Stage. Réglez l’orientation de la fonction de propagation de point à double hélice de la perle fluorescente pour être verticale.
Cette orientation verticale est définie comme le point de départ de l’étalonnage Z. Scannez 30 marches au-dessus et au-dessous de la position Z de départ par incréments de 50 nanomètres. Enregistrez 10 images à chaque étape en utilisant un temps d’exposition de 0,03 seconde.
Pour démarrer l’acquisition automatisée de données, cliquez sur Go under Z-Calibration. Centrifugeuse d’un millilitre de culture yersinia enterocolitica choquée par la chaleur à 5000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante, puis enlever la culture et jeter le supernatant. Lavez la pastille trois fois avec un millilitre de médias M2G.
Après le rinçage final, resuspendez les bactéries granulées dans 250 microlitres de médias M2G. Ajoutez ensuite des perles fluorescentes à utiliser comme marqueurs fiduciaux. La solution de perle fluorescente doit être ajoutée de sorte qu’il n’y ait qu’une à deux perles par champ de vision lorsqu’elles sont vues au microscope.
Mélanger délicatement la suspension en tourbillonnant pour séparer les cellules agrégées et la plaque 1,5 microlitres de la suspension sur un tampon d’agarose de 1,5 à 2 % fait de M2G, puis inverser la garniture et la placer sur un glissement de couvercle de microscope nettoyé à l’ozone. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope et placer le porte-échantillon sur le stade du microscope et le fixer en place. Initialisez l’interface utilisateur graphique pour contrôler la caméra du microscope, l’étape de l’échantillon et les lasers d’excitation, puis initialisez le logiciel de la caméra.
Dans l’onglet Capture sous la section Contrôle de la caméra, réglez le temps d’exposition à 0,025 seconde, puis cliquez en direct pour commencer un flux en direct de la caméra. Ajustez les positions X et Y de l’étape du microscope en cliquant sur les flèches XY-Position sous la section Étape de micro-positionnement pour numériser autour de l’échantillon et trouver un champ de vision avec une population suffisamment dense de cellules bactériennes. Pour maximiser le débit des données, la densité cellulaire sur le glissement de couverture doit être aussi élevée que possible sans que les cellules se chevauchent ou se touchent.
Le champ de vision devrait également inclure au moins une perle fluorescente comme marqueur fiducial de sorte que le décalage d’étape puisse être mesuré pendant que les données sont acquises. Ajustez ensuite la position Z de l’étape du microscope en cliquant sur les flèches Z-Position sous la section Nano-Positioning Stage de sorte que les lobes de fonction à double hélice des perles fluorescentes soient verticaux. Ensuite, passez à Séquence et sélectionnez Paramètres d’analyse.
Changez le nombre de nombres d’images à 20 000. Choisissez ensuite un dossier de destination enregistrer en cliquant sur le bouton marqué de trois points. Enfin cliquez sur Démarrer pour collecter jusqu’à 20.000 images de caméra en utilisant un court temps d’exposition de 0,025 secondes.
Une fois terminé, bloquez l’éclairage laser en cliquant sur le bouton Laser proche approprié dans l’interface utilisateur graphique. Puis collecter 200 images sombres en utilisant le même temps d’exposition. Cochez la case à côté de Thorlabs LED, puis cliquez sur Toggle Mirror Up.This va allumer la lumière LED au-dessus de l’échantillon et passer le microscope de la voie de fluorescence à la voie de contraste de phase.
Initialisez le logiciel d’acquisition de données sur la voie de contraste de phase et appuyez sur le bouton Démarrer/Arrêter l’affichage en direct pour afficher un flux en direct depuis la caméra. Cliquez ensuite sur Capture et Allez enregistrer l’image pour collecter une image de contraste de phase des cellules dans le champ de vision actuel. Adaptez la perle fluorescente pour une utilisation comme marqueur fiducial.
Trouvez et adaptez toutes les localisations et tous les cadres de caméra à l’aide des seuils de modèle décrits dans le protocole texte. Sous la section Localiser DHPSF SM de l’interface graphique Easy-DHPSF, cliquez sur Exécuter pour s’adapter aux signaux d’une molécule unique, puis cliquez sur OK sur les fenêtres contexturées suivantes pour conserver les paramètres par défaut. Le logiciel trouvera des signaux de fluorescence à molécule unique qui ressemblent à la fonction de propagation des points à double hélice, puis tenteront de les adapter à l’aide d’un modèle double-gaussien.
Au fur et à mesure que le script s’exécute, l’utilisateur verra un affichage des données d’image brutes ainsi qu’une image reconstruite des signaux mono molécule s’entisé avec succès. À l’aide d’un logiciel écrit sur mesure dans MATLAB, commencez par sélectionner manuellement cinq paires de points de contrôle dans la fenêtre contexturée en estimant et en cliquant approximativement sur les pôles cellulaires des cinq mêmes cellules dans les données de localisation à molécule unique et les contours cellulaires. Supprimez les cellules contenant moins de 10 localisations et supprimez les cellules qui sont placées partiellement en dehors du champ de vision, puis supprimez les cellules indésirables supplémentaires dans la fenêtre contexturée en cliquant à l’intérieur de leur contour cellulaire.
Enfin, attribuez à cette cellule des localisations qui se trouvent à l’intérieur des limites du contour d’une cellule. Jetez les localisations qui ne se trouvent dans aucun contour cellulaire. Un facteur essentiel pour l’application réussie de ce protocole est de s’assurer que les signaux d’une molécule unique sont bien séparés les uns des autres.
S’il y a plus d’une molécule de fluoration dans une cellule en même temps, alors la localisation peut être incorrectement assignée à la trajectoire d’une autre molécule. Ce protocole permet d’éliminer le problème de liaison en rejetant les trajectoires pour lesquelles deux localisations ou plus sont simultanément présentes dans la même cellule. Ainsi, si les signaux d’une molécule unique sont trop denses, une grande quantité de ces données sont automatiquement rejetées pendant le traitement.
Selon les niveaux d’expression des protéines de fusion étiquetées fluorescentes, environ 200 à 3000 localisations peuvent être générées par cellule. Ces localisations peuvent donner entre 10 et 150 trajectoires. Un grand nombre de trajectoires sont nécessaires pour produire des distributions bien échantillonnées.
On voit ici l’histogramme des coefficients de diffusion apparents pour près de 80 000 trajectoires mono molécule de la protéine de sécrétion YscQ de type 3 YscQ de type Yersinia étiquetée avec de la protéine fluorescente eYFP. L’YscQ se lie aux injectisomes intégrés à la membrane, ce qui entraîne une fraction des molécules, environ 24 % qui ne diffusent pas, comme l’indique la distribution indiquée en noir. Les molécules restantes d’YscQ diffusent librement dans le cytosol.
Au cours de la méthode décrite ici, il est déterminé que les molécules yscQ non liées existent dans au moins trois états diffusifs distincts. Cette conclusion a été tirée en adaptant la distribution des coefficients de diffusion apparents à une bibliothèque de distributions simulées avec des coefficients de diffusion connus. Lorsqu’on tente de résoudre plusieurs états diffusifs, plusieurs milliers de trajectoires à molécule unique devraient être recueillies pour s’assurer que les distributions apparentes du coefficient de diffusion sont très bien échantillonnées.
Le suivi d’une molécule unique peut être effectué dans des cellules de type sauvage ou chez des mutants de suppression génétique afin de déterminer si des états diffusifs spécifiques ne se manifestent que lorsqu’un partenaire de liaison moléculaire est présent. En résolvant les états diffusifs des protéines cytosoliques et des complexes protéiques à l’aide du suivi 3D d’une molécule unique, les chercheurs peuvent déterminer où, quand et comment les complexes de protéines oligomériques se forment dans les cellules vivantes. Travailler avec des sources laser de haute puissance et des agents pathogènes humains vivants peut être extrêmement dangereux.
Les protocoles appropriés de sécurité au laser et de biosécurité doivent toujours être respectés.
