Ce protocole décrit la synthèse d’un système de nanoparticules capable de faire taire les gènes in vivo en fournissant des siARN avec une grande efficacité. En échangeant simplement le peptide de ciblage et la charge utile de siRNA, les nanoparticules fusogéniques peuvent être employées comme formulation thérapeutique potentielle pour des maladies qui exigent la modulation in vivo de gène. Nous avons déjà publié des résultats utilisant le nanoplateforme fusogénique contre les infections bactériennes gram-positives en faisant taire un gène qui code pour l’inflammation dans les macrophages pour mettre fin à l’inflammation chronique.
Avant d’effectuer cette procédure, assemblez une cellule d’échage de téflon contenant une plaquette de silicium dans une solution d’acide fluorhydrique trois contre un. Exécutez un courant alternatif d’une forme d’onde carrée avec une faible densité de courant de 50 milliamperes par centimètre au carré pendant 0,6 seconde et une densité de courant élevée de 400 milliamperes par centimètre au carré pendant 0,36 seconde répétée pendant 500 cycles. Une fois la gravure terminée, retirer la cellule du circuit et rincer soigneusement la solution d’acide fluorhydrique à l’aide d’une seringue.
Rincez ensuite trois fois à l’éthanol. Pour enlever la couche poreuse de la plaquette de silicium, remplissez d’abord le puits de la cellule d’échage de 10 millilitres d’une solution d’acide fluorhydrique d’un à 29. Ensuite, exécutez une constante de 3,7 milliamperes par centimètre au carré pendant 250 secondes.
Une fois la gravure terminée, retirez la cellule du circuit. La couche poreuse de silicium peut avoir des ondulations visibles, indiquant le détachement de la gaufrette cristalline de silicium. Laver délicatement la solution d’acide fluorhydrique et rincer trois fois chacun avec de l’éthanol et de l’eau.
À l’aide d’une pointe de pipette, fendre fermement la circonférence de la couche de silicium poreux pour un détachement complet. À l’aide d’éthanol, recueillir les fragments de silicium poreux, ou copeaux, de la cellule d’échasse de Téflon dans un bateau de pesage. Ensuite, transférez les copeaux sur un flacon de verre pour le stockage.
Ensuite, remplacez l’éthanol dans le flacon de verre contenant les copeaux de silicium poreux par deux millilitres d’eau sans RNase. Fermement capuchon et sceller le flacon à l’aide de Parafilm. Placez le flacon de verre dans un bain sonicateur et suspendu de telle sorte que le volume de copeaux de silicium poreux sont complètement immergés sous la surface du bain d’eau.
Pour éviter une perte d’eau importante pendant la sonication, placez un flacon volumétrique rempli d’eau, inversé de sorte que l’ouverture du flacon touche la surface du bain d’eau. Puis, sonicate les puces de silicium poreux pendant 12 heures à 35 kilohertz avec une puissance RF de 48 watts. Après la sonication, placez le flacon de verre sur une surface plane pendant une heure pour permettre aux particules plus grosses de se déposer au fond.
Ensuite, recueillir le surnatant à l’aide d’une pipette. Dans un flacon de verre, ajouter 72,55 microlitres de solution DMPC, 15,16 microlitres de solution DSPE-PEG, et 19,63 microlitres de solution DOTAP, et mélanger par pipetting. Placez le flacon dans un capot de fumée avec un capuchon lâche pour permettre au solvant de s’évaporer pendant la nuit.
Le film séché sera une substance nuageuse, dure, gel-like au fond du flacon. Ensuite, placez un tube de microcentrifugeuse contenant 150 microlitres de nanoparticules de silicium poreux dans un bain de sonication glacée préparé précédemment. Sous ultrasonication de 15 minutes, pipette doucement 150 microlitres de siRNA et 700 microlitres de chlorure de calcium bi molaire dans les nanoparticules poreuses de silicium.
Retirez le tube contenant un millilitre de nanoparticules poreuses de siRNA recouvertes de calcium du sonicateur. Remplissez un large bécher d’eau déionisée. Faire tremper une membrane en polycarbonate et quatre supports de filtre en les faisant flotter à la surface de l’eau.
Ensuite, assemblez un kit d’extrusion liposome en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, hydratez le film lipidique séché dans le flacon de verre avec un millilitre des nanoparticules poreuses de siRNA recouvertes de calcium. Pipette jusqu’à ce que tous les lipides se soient levés du fond du flacon et qu’une solution nuageuse et homogène soit observée.
Ajouter une barre magnétique d’agitation au flacon de verre et placer le flacon sur une plaque chauffante pour chauffer les particules à 40 degrés Celsius tout en remuant magnétiquement la solution pendant 20 minutes. Par la suite, fixez une seringue vide d’un côté de l’extrtruder. Ensuite, remplissez une autre seringue d’un millilitre de la solution poreuse de nanoparticules de silicium poreuse enduite de lipides et fixez la seringue de l’autre côté de l’extrème.
Commencez l’extrusion en poussant le piston lentement pour pousser les particules d’une seringue, à travers la membrane de polycarbonate, et dans l’autre seringue. Répéter 20 fois. Ensuite, recueillir les particules extrudées dans un tube de microcentrifugeuse.
Préparer un bouillon de peptide avec une concentration de peptide d’un milligramme par millilitre dans de l’eau exempte de RNase. Dans le tube de microcentrifugeuse contenant les nanoparticules poreuses de silicium poreuses enrobées de lipides fusogéniques, ajouter 100 microlitres du bouillon de peptide et pipette doucement. Maintenez le tube statique à température ambiante pendant 20 minutes.
Pour éliminer l’excès de peptide ou de siRNA et d’autres excipients, lavez-le dans un filtre centrifuge de 30 kilodaltons en tournant à 5000 fois g à température ambiante pendant une heure. Centrifugeuse deux fois de plus avec un millilitre de PBS dans les mêmes réglages. Après centrifugation, resuspendez les nanoparticules poreuses de silicium poreuses conjuguées au peptide final dans PBS à la concentration désirée.
Les particules peuvent être aliquoted et stockées à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 jours. Une synthèse réussie des nanoparticules poreuses fusogenic de silicium devrait produire une solution homogène et légèrement opaque qui peut être stockée pendant 30 jours et décongelée sans causer des changements structurels. Le défaut d’optimiser le rapport et la concentration, ainsi que les cycles répétés de gel-dégel peuvent conduire à l’agrégation lors du chargement.
Comme les particules sont extrudées, le diamètre hydrodynamique moyen des nanoparticules de silicium poreux fusogéniques mesurées par la diffusion dynamique de la lumière devrait être d’environ 200 nanomètres et le potentiel moyen de zéta environ positif sept millivolts. Après modification de surface avec des peptides de ciblage, le diamètre global devrait être inférieur à 230 nanomètres, et le potentiel zeta moyen diminue à moins 3,4 millivolts. La fusion peut être confirmée en étiquetant les lipides fusogéniques avec le fluorophore lipophile DiI et en observant la localisation in vitro à l’aide de microscopie confoccale.
Une fusion réussie est observée lorsque les lipides de la nanoparticule de silicium poreux fusogénique transfèrent le DiI à la membrane plasmatique et sont localisés indépendamment des lysosomes. La fusion infructueuse montrera la localisation de DiI dans le cytoplasme de la cellule et la co-localisation avec des lysosomes. Ce système de nanoparticules fusogènes est maintenant utilisé pour des applications thérapeutiques non seulement dans les infections bactériennes, mais aussi dans la thérapie adjuvante contre le cancer et l’immunothérapie contre le cancer.
Ce protocole peut être encore optimisé pour charger plus de siARN. Le système de nanoparticules fusogènes a montré un potentiel dans le chargement et la livraison de charges utiles anioniques plus grandes, telles que les ARNH et les complexes CRISPR/Cas9.
