Ce protocole décrit la préparation et l’analyse d’un biocapteur unique qui a été conçu pour détecter les composants chimiques des résidus de coups de feu. L’utilisation de biocapteurs pour des applications médico-légales est unique. Il représente une alternative simple et peu coûteuse à utiliser à l’instrumentation hautement spécialisée généralement utilisée dans les laboratoires médico-légaux.
Les méthodes de biologie synthétique décrites peuvent être utilisées pour n’importe quel système qui utilise des pièces de biologie synthétique standard. L’analyse chimique décrite s’applique à tout biocapteur qui exprime des protéines fluorescentes rouges. Andrea Soles et Elle Richardson, étudiantes de premier cycle à l’Université Longwood, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer cette procédure, ajouter dix microlitres de l’ADN plasmide J10060 précédemment isolé à un tube de microcentrifugeuse. Ajouter huit microlitres d’eau et un microlitre de chacune des enzymes EcoRI et NHEL pré-mélangées à un microlitre de tampon. Pour l’ADN promoteur, ajouter dix microlitres de séquences d’ADN promoteur annealed à un tube de microcentrifugeuse fraîche.
Ajouter huit microlitres d’eau et un microlitre de chacune des enzymes EcoRI et NHEL pré-mélangées à un microlitre de tampon. À l’aide d’une pipette réglée sur dix microlitres, pipette doucement les échantillons de haut en bas pour mélanger. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Puis, chauffer et activer les enzymes à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Conserver l’ADN digéré dans un congélateur jusqu’à ce qu’il soit prêt à aller de l’avant. Tout d’abord, utilisez l’ADN plasmide et promoteur qui ont déjà été digérés pour installer la réaction dans un tube de microcetrifugeuse sur la glace, tel que décrit dans le tableau un du protocole de texte.
En s’assurant d’ajouter le T4 ADN Ligase dernière. Pipette de haut en bas doucement pour mélanger la réaction, et centrifugeuse brièvement. Incuber à température ambiante pendant dix minutes.
Puis, chauffer et activer à 65 degrés Celsius pendant dix minutes. Effectuez la transformation comme indiqué dans le protocole de texte. Tout d’abord, configurer les mélanges de réaction pour PCR tels qu’ils sont décrits dans le tableau deux du protocole texte.
Pipette doucement de haut en bas pour mélanger les réactions. À l’aide d’une pointe de pipette jaune, gratter une colonie d’E.coli transformée. Transférez un balayage de cet E.coli sur une nouvelle plaque d’agar lb-ampicilline qui a été sectionnée, puis insérez la pointe de pipette dans le tube PCR.
Secouez la pointe de la pipette pour mélanger l’E.Coli avec le mélange PCR. Répétez ce processus trois fois de plus pour d’autres colonies. Ensuite, chargez les tubes PCR dans une machine PCR, et commencez le thermocyclisme tel qu’il est décrit dans le tableau trois du protocole de texte.
Pour commencer à étiqueter le nombre approprié de tubes de culture stérile tels qu’ils sont décrits dans le tableau quatre du protocole texte. Ajouter deux millilitres de bouillon de culture préparé à chaque tube. Ajouter la solution de stock d’anilite aux tubes comme indiqué dans le tableau quatre.
Ensuite, placez les bouchons sur les tubes de culture afin qu’ils soient lâches pour permettre à l’air de circuler dans le tube. Vortex chaque tube de culture. Après cela, placez les tubes dans un incubateur secouant à 37 degrés Celsius et à 220 RPM pendant au moins 24 heures.
Tout d’abord, utilisez un lingette à base d’éthanol conçu pour enlever le plomb pour essuyer toutes les surfaces des mains, y compris entre les doigts. Conservez les lingettes dans un sac étanche dûment étiqueté jusqu’à l’analyse. Utilisez un lingette à base d’alcool pour essuyer toutes les grandes surfaces à tester.
Utilisez un échange de coton humidifié avec de l’éthanol pour essuyer toutes les petites surfaces à tester. Porter des gants propres et utiliser des ciseaux qui ont été nettoyés avec de l’alcool, couper une section qui est d’environ un centimètre carré du centre de l’essuie-glace. Ensuite, placez le morceau de lingette coupé, ou coton-tige, directement dans un tube de culture contenant deux millilitres de la bactérie du capteur, et assurez-vous qu’il est complètement immergé dans le bouillon.
Préparez le spectromètre pour recueillir la soumission fluorescente à la longueur d’onde appropriée pour la variante DP, avec une longueur d’onde d’excitation de 500 nanomètres. Ensuite, utilisez un mélangeur vortex pour secouer les tubes. Transférez soigneusement chaque supernatant dans une cuvette à faible volume et recueillez l’intensité des émissions.
À l’aide d’un mélangeur vortex, secouer les tubes. Transférer 200 microlitres du bouillon dans un puits de la plaque de puits. Enregistrez quels échantillons sont entrés dans chaque puits de cette plaque.
Installez le flouromètre pour recueillir l’intensité des émissions à la longueur d’onde appropriée pour la variante DP. Les spectres de fluorescence d’une variante représentative de la DP montrent à la fois le contrôle négatif et les spectres à deux niveaux différents d’anilite ajoutés. Le signal fluorescent maximal pour la variante DP utilisée dans ce travail est observé à 575 nanomètres.
Des données représentatives sont recueillies pour le même ensemble de solutions, à la fois à partir du spectromètre portatif et du fluoromètre. Il y a une tendance générale de la fluorescence augmentant pendant que la concentration de l’anilite augmente. Il convient de noter qu’à des concentrations élevées, supérieures à environ 800 parties par milliard pour le capteur de plomb, la réponse diminue en raison de la toxicité du plomb à une concentration aussi élevée.
L’analyse d’échantillons d’écouvillons à l’éthanol provenant de l’intérieur d’un boîtier de cartouche de calibre 40 usagé fournit une preuve des résultats principaux. Les résultats positifs de chacune des trois bactéries du capteur indiquent un test positif pour les résidus de coups de feu. Les biocapteurs préparés dans ce protocole peuvent également être utilisés individuellement pour détecter la contamination des aliments, de l’eau ou des échantillons environnementaux.
Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour développer des biocapteurs en utilisant des techniques standard de biologie synthétique pour une variété d’anilites chimiques différentes. L’équipement de protection individuelle doit être porté, et les analystes devraient se laver les mains et désinfecter les surfaces après avoir manipulé E.coli. Les déchets doivent être autoclavés, et tous les déchets contenant du métal lourd doivent être traités en conséquence.
