Les méthodes optiques, telles que l’optogénétique, peuvent fournir la modulation précise des signaux moléculaires cellulaires. Notre protocole a démontré une manipulation optique orale des moléculaires cellulaires de signal par stimulation de laser de femtoseconde. En couplant notre laser femtoseconde dans un microscope confocal, notre technique peut fournir une opération à cellule unique ou subcellulaire par stimulation laser femtoseconde et la surveillance dynamique moléculaire en temps réel par microscopie confocale.
Cette méthode peut être appliquée à tous les systèmes de microscopie fluorescente en coupant un laser femtoseconde dans le système de la bonne manière. Pour toute personne qui essaie notre méthode pour la première fois, s’il vous plaît suivre les instructions distinctes de l’installation laser ou demander conseil à des professionnels lors de l’exploitation d’une source laser femtoseconde laboratoire. Pour commencer, allumez le laser femtoseconde et le microscope confocal.
Utilisez des miroirs réfléchissants pour diriger le faisceau laser femtoseconde à travers un obturateur mécanique. Ensuite, placez un télescope relais composé d’une paire de lentilles pour augmenter la largeur du faisceau de transmission. Cela devrait être compatible avec l’ouverture arrière de l’objectif.
Maintenant, dirigez les miroirs réfléchissants pour aligner le faisceau élargi dans le microscope. Ajustez les deux miroirs réfléchissants, soulignés ici, pour régler la mise au point du laser femtoseconde au centre du champ de vision. Enfin, mesurez et accordez les lasers tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne.
Culture Cellules Hela en utilisant des techniques standard. Lorsqu’elles sont prêtes à effectuer l’expérience, transfectez les cellules avec ERK2-GFP tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, allumez le microscope confocal à balayage laser et le laser femtoseconde.
Assurez-vous que l’obturateur du laser est fermé. Ensuite, ouvrez le logiciel microscope. Réglez le laser d’excitation à 488 nanomètres, et réglez son niveau de puissance à 0,1 milliwatts.
Définissez la taille de l’imagerie comme 512 par 512 pixels, et le temps d’intervalle de chaque pixel comme 2,4 microsecondes. Ensuite, réglez le temps d’intervalle entre deux images à six secondes pour minimiser le blanchiment des photos et les dommages photo aux cellules. En outre, réglez le total des cadres d’imagerie à environ 300 images pour fournir environ 30 minutes de microscopie continue dans une expérience individuelle.
Prenez le plat contenant les cellules Hela transfectées avec ERK2-GFP de l’incubateur, et mettez le plat sur la scène du microscope. Dans le logiciel, commencez le mode de balayage rapide, et accordez l’objectif d’acquérir des images fluorescentes claires des cellules. Ensuite, arrêtez de scanner rapidement et passez en mode imagerie à champ lumineux à l’aide de la caméra CCD.
Ouvrez l’obturateur et ajustez la distance entre les deux lentilles du télescope relais pour vous assurer que le diamètre de la mise au point laser femtoseconde est d’environ deux microns. Ensuite, fermez l’obturateur pour compléter l’ajustement. Réglez la puissance du laser femtoseconde à 15 à 40 milliwatts pour un laser de 810 nanomètres, ou un laser de 20 à 60 milliwatts pour un laser de 1040 nanomètres.
Ensuite, réglez l’heure d’ouverture de l’obturateur à 05 à 0,2 seconde. Utilisez le mode de numérisation rapide pour sélectionner une cellule cible qui exprime fortement ERK2-GFP. Une fois trouvé, déplacez la scène afin de localisér la zone de cytosol de la cellule cible sélectionnée de sorte qu’elle soit au centre du champ de vision lorsqu’elle est sous imagerie à champ lumineux.
Une fois centré, cliquez sur le bouton de démarrage pour commencer l’imagerie continue. Ouvrez l’obturateur à n’importe quelle plage horaire prédéfini pour fournir la stimulation laser femtoseconde dans la cellule cible. Lorsque le processus d’imagerie est terminé, enregistrez les données d’imagerie pour une analyse plus approfondie.
Réglez la puissance du laser femtoseconde à 15 à 40 milliwatts et 810 nanomètres et 20 à 60 milliwatts et 1040 nanomètres à l’échantillon. Ensuite, prenez le plat contenant des cellules transfectées avec ERK2-GFP de l’incubateur et mettez-le sur la scène du microscope. Utilisez le mode de balayage rapide pour sélectionner la cellule cible exprimant bien ERK2-GFP.
Ensuite, définissez le processus d’imagerie confocale et définissez un cadre de balayage spécial comme cadre de stimulation dans le processus d’imagerie. Définissez le paramètre du cadre de stimulation. Réglez une région de balayage de deux par deux à trois par trois microns carrés à la zone de cytosol près du noyau dans la cellule cible.
Réglez le temps total de numérisation à 0,1 à 0,2 seconde. Réglez le temps d’intervalle entre deux images à six secondes et définissez les images totales à environ 300 images pour fournir environ 30 minutes de microscopie continue. Enregistrez les données d’imagerie pour une analyse plus approfondie des données.
Synchronisez l’obturateur du laser femtoseconde avec celui de la numérisation confocale en fonction de la zone de stimulation photo prédéfinie qui n’est ouverte que lorsque le balayage laser tombe dans le cadre de stimulation. Cliquez sur le bouton de démarrage pour démarrer le processus continu d’imagerie par microscopie. Pour observer la dynamique morphologique mitochondriale, les cellules transfect hela avec Mito-GFP pour indiquer fluorescentement les mitochondries, ou une base avec mito-cpYFP pour observer des mitoflashes.
Après la transfection, allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l’obturateur est fermé. Ensuite, allumez le microscope confocal à balayage laser. Réglez le laser excitation à 488 nanomètres.
Ensuite, réglez le niveau de puissance du laser de 488 nanomètres à 0,1 milliwatt. En outre, réglez la taille de l’imagerie à 512 par 512 pixels et le temps total d’imagerie de chaque image à 2,2 secondes. Ensuite, définissez le temps d’intervalle entre deux images à zéro seconde et les images totales comme 200 images pour fournir environ 440 secondes de microscopie continue dans une expérience individuelle.
Prenez le plat contenant des cellules transfectées avec mito GFP ou mitochondrial-ciblé circulairement permuté protéine fluorescente jaune de l’incubateur et mettre le plat sur le stade du microscope. Vérifiez l’état du laser femtoseconde pour vous assurer que la mise au point du laser femtoseconde est située au centre du champ de vision. Ensuite, placez une flèche de référence au centre de la fenêtre d’imagerie fluorescente pour indiquer la position de la mise au point.
Ensuite, réglez la puissance du laser femtoseconde à cinq à 30 miliwatts avec le laser à 810 nanomètres et 10 à 40 milliwatts pour le laser à 1040 nanomètres. Réglez l’heure d’ouverture de l’obturateur à 05 à 0,1 seconde. Utilisez le mode de balayage rapide pour sélectionner la cellule cible qui exprime bien le Mito GFP ou la protéine fluorescente jaune permutée circulairement ciblée par mitochondrique.
Sélectionnez une mitochondrion au hasard dans la cellule cible comme sujet expérimental. Ensuite, déplacez l’étape du microscope afin de localiser la structure tubulaire mitochondriale cible au centre du champ de vision par le mode de balayage rapide comme indiqué par la flèche de référence. Cliquez sur le bouton de démarrage pour commencer l’imagerie continue.
Enfin, ouvrez l’obturateur à tout moment prédéfini pour fournir la stimulation laser femtoseconde dans la structure tubulaire mitochondriale cible. Attendez que le processus d’imagerie soit terminé, puis enregistrez les données d’imagerie pour une analyse plus poussée des données. En utilisant la méthode présentée dans ce protocole, ERK2 se translocalise dans le noyau après avoir été traité avec un court flash du laser femtoseconde.
La fluorescence ERK2-GFP atteint le maximum après plusieurs minutes de stimulation laser femtoseconde. Les molécules ERK2 seront déphosphorylatées après avoir activé les substrats en aval dans le noyau, puis l’ERK2 revient au cytoplasme indiqué par une diminution de la fluorescence nucléaire du GFP. ERK2 peut être activé plusieurs fois par plusieurs stimulations photo.
Par conséquent, il est possible de manipuler le modèle de signal ERK2 précisément en contrôlant le temps d’intervalle entre plusieurs stimuli. En outre, ERK2 peut parfois être activé dans les cellules adjacentes autour de la cellule stimulée. Cette observation indique que certaines molécules diffusibles peuvent être libérées par la cellule traitée avec le laser femtoseconde pour activer ERK2 dans les cellules adjacentes.
La phosphorylation de la protéine eIF4E en aval eRK2 peut être confirmée individualisée par microscopie d’immunofluorescence. Ce résultat indique que la stimulation laser femtoseconde peut activer avec succès la voie de signalisation ERK. Les éclairs oxydatifs mitochondriaux ou les mitoflashes sont des éclats oxydatifs dans les mitochondries qui s’enracinent dans la dynamique moléculaire complexe.
La mise en œuvre de ce programme de stimulation photo a donné lieu à une excitation réussie de mitoflash. Cette stimulation photo montre également des variétés de dynamique moléculaire mitochondriale comprenant la fragmentation et la restauration de la morphologie mitochondriale ainsi que l’oscillation du potentiel memitochondrial de membrane. Semblables aux mitoflashes activés par photo, ces événements de mitochondrie ont des performances différentes avec différentes intensités de puissance.
La chose la plus importante est de s’assurer que la mise au point, la taille et la précision du laser femtoseconde est une propriété pour la stimulation dans les cellules. Le laser femtoseconde proche infrarouge peut être dangereux pour les utilisateurs. Lorsque vous suivez ce protocole, portez une protection adéquate et il empêche le laser de se diffuser à partir de la table optique.
