Le protocole démontre une méthode fiable et reproductible pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de haute pureté à partir de souris qui pourraient avoir de multiples applications. Cette technique est une méthode plus simple qui préserve le rendement et la pureté des cellules endothéliales. La démonstration de la procédure sera assurée par Nina Nguyen, une associée de recherche de mon laboratoire.
Pour commencer, faites tourbillonner les billes magnétiques pendant quelques secondes. Pipeter 50 microlitres des billes dans deux tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre pour CD31 et CD102. Ajouter un millilitre de tampon de lavage de perles et bien mélanger.
Placez les tubes sur un séparateur magnétique et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Remettez les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon de lavage des perles. Ajoutez ensuite cinq microlitres ou 2,5 microgrammes d’anticorps CD31 ou CD102 à tous les 50 microlitres de billes.
Incuber la suspension de billes avec rotation douce sur un rotateur d’extrémité sur extrémité pendant une nuit à quatre degrés Celsius ou pendant trois heures à température ambiante. Lavez les immunobilles quatre fois, puis remettez les immunobilles en suspension dans 50 microlitres de tampon de lavage des perles. Le jour de l’isolement, ajoutez 25 millilitres de HBSS à 25 milligrammes de collagénase de type un et incuberez-le avec une rotation douce.
Ensuite, filtrez à l’aide d’un filtre de 22 micromètres. Après avoir euthanasié un chiot souris âgé de cinq à sept jours, vaporisez la carcasse avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, coupez le diaphragme vers le haut le long de toute la paroi latérale de la poitrine pour exposer la cavité thoracique.
Injectez cinq millilitres de DMEM froid dans le ventricule droit du cœur jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs. Ensuite, coupez les lobes distaux aux bronches correspondantes un par un pour enlever les poumons. Tirez les lobes pulmonaires dans un tube conique de 50 millilitres prérempli de 20 millilitres de milieu basal glacé.
Agitez doucement le tube à la main pendant 10 à 15 secondes pour laver tout excès de globules rouges. Retirez les poumons du média avec une passoire cellulaire et hachez avec des ciseaux stérilisés. Transférer le tissu haché dans le tube conique de 50 millilitres avec 25 millilitres de solution de collagénase préchauffée.
Agiter doucement sur un batteur rotatif. Fixez une seringue de 20 millilitres à une canule émoussée de calibre 15 et triturez vigoureusement la suspension sans mousser 10 à 15 fois dans une suspension cellulaire. Filtrer la suspension à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.
Rincez ensuite le tube conique utilisé pour la digestion et la passoire cellulaire avec 15 millilitres de milieu basal. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu complet.
Ajouter huit millilitres de milieu complet et incuber. Le lendemain, laver les flacons deux fois avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium et ajouter 10 millilitres de milieu complet. Une fois que les cellules sont confluentes à 90 à 95 %, elles sont prêtes pour l’isolement primaire des immunobilles.
Lavez deux fois les cellules endothéliales adhérentes avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium. Ajouter deux millilitres de solution de détachement cellulaire sans trypsine et l’incuber pour assurer le soulèvement de toutes les cellules du flacon. Ajouter huit millilitres de milieu basal.
Ensuite, faites tourner les cellules à 400 fois G pendant quatre minutes à température ambiante et remettez-les en suspension dans deux millilitres du milieu basal. Perles enduites anti-CD31 Vortex pendant quelques secondes pour remettre les billes en suspension. Ajoutez 30 microlitres de billes pour chaque deux millilitres de suspension cellulaire et fixez le couvercle.
Incuber le tube pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur d’extrémité au-dessus de l’extrémité. Placez ensuite les tubes sur un séparateur magnétique pendant deux minutes. Aspirez le surnageant et retirez le tube de l’aimant.
Remettez en suspension la pastille de cellule de bille en ajoutant trois millilitres de milieu basal au tube et en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Replacez le tube du séparateur magnétique pendant deux minutes. Aspirez ensuite soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
Après le lavage final, lorsque le surnageant devient clair, remettre en suspension la pastille de cellule de bille dans trois millilitres de milieu de croissance complet et la transférer dans une fiole T75. Ajouter sept millilitres du milieu de croissance complet et l’incuber. Le lendemain, relavez les cellules avec HBSS sans calcium ni magnésium.
Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu complet. Une fois que les cellules sont confluentes à 90 à 95 %, elles sont prêtes pour l’isolement secondaire des immunobilles. La première sélection d’immunobilles identifie les cellules CD31 positives, qui se développent dans une formation pavée.
Une deuxième sélection d’immunobilles avec des billes enrobées d’anti-CD102 augmente la pureté des cellules endothéliales et le tri cellulaire activé par fluorescence est utilisé pour confirmer que la population cellulaire est CD31 positive et CD102 positive. Pour étudier les voies inflammatoires endothéliales et la fonction de barrière endothéliale, un traitement par Cytomix murin a été utilisé pour induire une production significative d’IL-6 par les cellules endothéliales avec une valeur P inférieure à 0,01. De plus, la résistance transendothéliale a diminué, montrant une perméabilité endothéliale accrue.
Les cellules endothéliales isolées peuvent être utilisées dans les stimulations des cellules endothéliales ou les tests de fonction barrière pour découvrir des cibles thérapeutiques endothéliales pour les troubles de dysfonctionnement endothélial.
