Ce protocole a démontré une méthode standardisée de construction de tumeurs tridimensionnelles de sphéroïdes. Et cette méthodologie a fourni une analyse à haut circuit et à haute teneur des constructions tumorales 3D. En utilisant une méthode standard de construction sphéroïde tumorale et un système d’imagerie et d’analyse à haut débit, l’efficacité et la précision des tests de médicaments formés sur des sphéroïdes tridimensionnels peuvent être considérablement augmentées.
Dans ce protocole, nous avons utilisé AMG510 pour traiter le sphéroïde NCI-H23 à titre d’exemple. À partir de l’expérience, nous avons pu observer un effet significatif du médicament ciblé cancéreux sur les sphéroïdes tumoraux. Pour commencer, pipeter 100 microlitres de réactif anti-adhérence dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec un fond de puits en forme de U et conserver pendant 10 minutes.
Après 10 minutes, aspirez le réactif de revêtement et lavez deux fois avec du PBS stérilisé. Placez la plaque de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans de l’air humidifié avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’à utilisation. Observez les cellules au microscope.
Ensuite, lavez deux fois les cellules cultivées dans une fiole T25 avec du PBS pour éliminer le milieu de culture et traitez les cellules expansées avec un millilitre d’EDTA à 0,25% de trypsine pendant une à deux minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone. Confirmez la forme de la cellule au microscope. Et puis arrêtez le traitement à la trypsine en aspirant la suspension d’EDTA de trypsine utilisée dans le ballon T25 et en lavant les cellules avec quatre millilitres de milieu frais.
Transférer toute la suspension dans un tube de 15 millilitres et utiliser un millilitre de fluide frais pour laver les cellules résiduelles et l’ajouter au tube. Centrifuger les cellules à 186,48 G pendant cinq minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Ajouter 10 millilitres de milieu frais à la pastille cellulaire et pipeter doucement jusqu’à ce que les cellules soient dans une suspension homogène.
Aspirez 0,1 millilitre de suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger. Ajouter 0,9 millilitre de milieu frais, puis bien pipeter la suspension. Extraire 10 microlitres de la suspension cellulaire pour le comptage cellulaire.
Répétez ce processus une ou deux fois et prenez une valeur moyenne. Diluer la suspension pour atteindre une densité finale de semis de 50 000 cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de fond en U de 48 puits.
Enrouler le film d’étanchéité autour de la plaque et centrifuger à 119,35 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, retirez le film protecteur et ajoutez cinq à huit millilitres d’eau stérilisée dans le canal d’eau entourant les puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq jours.
Ne changez pas ou ne complétez pas l’eau dans le canal d’eau pendant cette période et observez l’agrégation cellulaire pendant les cinq jours suivants. Pour l’intégration du gel, après avoir retiré le gel congelé du réfrigérateur à moins 20 degrés Celsius, placez-le sur une glacière pendant toute la durée de l’expérience. Observez les sphéroïdes cellulaires au microscope.
Avant le début de l’encastrement du gel, l’état des sphéroïdes doit à nouveau être vérifié. Retirez délicatement 150 microlitres du milieu et incorporez chaque sphéroïde dans le gel en ajoutant lentement le gel liquide du côté de la paroi du puits tout en déplaçant l’embout de pipette prérefroidi autour et à l’intérieur du puits. Attendez cinq minutes et si le gel ne se propage pas uniformément, pipeter doucement le gel avec un embout de pipette de 10 microlitres.
Chaque puits contient un sphéroïde tumoral, 25 microlitres de gel de 3,5 milligrammes par millilitre et 50 microlitres de milieu de culture complet. Ajoutez également 75 microlitres de milieu aux contrôles. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce que l’hydrogélification soit complètement terminée.
Confirmez l’état de gélification au microscope. Superposez 125 microlitres de milieu frais sur chaque échantillon et cultivez les sphéroïdes pendant 7 à 10 jours supplémentaires. Préparez des groupes de sphéroïdes avec quatre à six puits chacun et choisissez-en au moins trois pour analyse.
Dissoudre le médicament selon les instructions du fabricant et préparer des solutions de travail 100 fois avec du DMSO. Utilisez 0,1% de DMSO comme témoin positif et ajoutez 125 microlitres de milieu traité par médicament à chaque puits. Replacez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius dans de l’air humidifié contenant 5% de dioxyde de carbone.
À ce stade, chaque puits contient un sphéroïde tumoral, 25 microlitres de gel de 3,5 milligrammes par millilitre et 175 microlitres du milieu. Les contrôles contiennent 200 microlitres du milieu. Mesurer la viabilité du sphéroïde à l’aide d’un kit de dosage alamarBlue conformément aux directives du fabricant.
Aspirer 100 microlitres du milieu surnageant de chaque puits vers une nouvelle plaque d’essai. Ensuite, mesurez la viabilité à l’aide d’un photomètre à microplaques. Mesurez-le le premier jour, le quatrième jour, le septième jour et le jour 10 après avoir incorporé les sphéroïdes dans le gel.
Ajouter 80 microlitres de milieu frais à chaque puits de la plaque de culture. Ensuite, remplacez 100 microlitres supplémentaires du milieu traité par le médicament. Assurez-vous qu’il n’y a pas de restes d’alamarBlue dans le puits.
Aspirer 100 microlitres du milieu avant l’imagerie et placer la plaque sur la scène. Obtenez des images numériques des sphéroïdes à l’aide d’un microscope automatisé avec un objectif décuplé. Le microscope peut focaliser et centraliser ces sphéroïdes automatiquement.
Attendez l’imagerie automatique. Quatre images sont acquises pour chaque sphéroïde. Une image intégrée est formée et traitée avec le logiciel connecté au système d’imagerie à haut contenu.
Cliquez sur le bouton de processus de patch d’image et choisissez les images intégrées dans le logiciel. Choisissez U net model et tapez le taux de conversion. Cliquez en bas de l’écran pour lancer le traitement de l’image.
Enregistrez les données de diamètre, de périmètre et de rugosité dans le tableur. Enfin, ajoutez 100 microlitres de milieu frais avec le médicament et replacez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius dans de l’air humidifié contenant 5% de dioxyde de carbone. Les images en fond clair de sphéroïdes à cellules NCI-H23 traitées avec différentes concentrations d’AMG510 et capturées automatiquement par un microscope à haute teneur sont montrées dans cette figure.
Les colonnes représentent différents jours et les rangées représentent différentes concentrations de médicaments. Les résultats incluent trois sphéroïdes pour chaque condition. La viabilité sphéroïde tumorale des groupes d’échantillons traités par AMG510 a été mesurée le premier jour, le quatrième jour, le septième jour et le jour 10.
La viabilité cellulaire terminale des échantillons avec des gradients de concentration est illustrée dans cette figure. Les diamètres sphéroïdes de la tumeur ont été mesurés le premier jour, le quatrième jour, le septième jour et le jour 10. Le taux de croissance sphéroïde a été défini comme le volume terminal par rapport au volume original et calculé à l’aide des diamètres des sphéroïdes.
Le taux d’inhibition de la croissance sphéroïde a été défini par rapport au volume et calculé à l’aide des diamètres des sphéroïdes. La rugosité tumorale a été mesurée par le logiciel le premier jour, le quatrième jour, le septième jour et le jour 10, indiquant le caractère invasif des sphéroïdes tumoraux. Le périmètre du sphéroïde a été localisé et dessiné par le logiciel à l’aide d’algorithmes d’apprentissage profond.
Les zones sphéroïdes au plan focal ont ensuite été mesurées par l’image J et un indice de périmètre excédentaire a été calculé sur la base de ces données. Bien que ce message soit facile à suivre, les échantillons doivent encore être manipulés avec soin.
