This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

1 Préparation de molécules d&#39;ARN pour une seule molécule Tweezing <ol><li> Clonage de la séquence d&#39;intérêt. Clonage de la séquence d&#39;ADN correspondant à la structure de l&#39;ARN dans un vecteur. </li><li> Synthèse et purification de la matrice de transcription. Synthétiser un modèle de transcription par PCR. [Lieu le tableau 1 ici] Ensuite, purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR, et concentrer l&#39;échantillon à&gt; 200 ng / ul. Étant donné que l&#39;ADN purifié est utilisé pour la transcription, la RNase eau libre doit être utilisé dans l&#39;élution et concentration. </li><li> La transcription in vitro. La synthèse d&#39;ARN par transcription in vitro à 37 ° C pendant une nuit afin de maximiser le rendement en ARN. [Lieu le tableau 2 ici] Après transcription, ajouter 1 pl DNase I à digérer la matrice d&#39;ADN pendant 15 min à 37 ° C. On purifie l&#39;ARN en utilisant une colonne de centrifugation de silice. </li><li> Synthèse de la poignée biotinylé A. Tout d&#39;abord, produire la poignée non modifié par PCR utilisant des amorces Af et Ar et concEntrate l&#39;ADN amplifié à&gt; 200 ng / ul. Ensuite, incorporer des modifications de la biotine dans le produit de PCR en utilisant une réaction d&#39;extension d&#39;amorce. [Lieu tableau 3 ici] REMARQUE: La poignée biotinylé A (biotine-HA) peut être utilisé directement dans le recuit sans purification. Comme la biotine-HA doit être recuite à ARN, il est essentiel d&#39;utiliser la RNase eau libre dans les deux étapes. </li><li> Synthèse de la poignée de la digoxigénine-modifié B. Synthétiser digoxigénine modifié poignée B (dig-HB) par PCR en utilisant une amorce oligo Bf et la digoxigénine modifié Dig-Br (figure 3). Ensuite, purifier le produit de PCR et concentrer l&#39;échantillon à&gt; 200 ng / ul. </li><li> ARN de recuit sur les poignées. Recuit de l&#39;ARN avec des poignées. [lieu tableaux 4 et 5 ici] </li><li> Purifier l&#39;échantillon recuit. Ajouter 3 volumes d&#39;éthanol de l&#39;échantillon recuit et bien mélanger. Stocker le mélange à -70 ° C pendant au moins 1 h. Isoler à 15 800 xg et éliminer le surnageant. Sécher les granulés à l&#39;aide d&#39;un lyophilisateur. Dissoudre le culot dans100 de l&#39;eau sans RNase ul. NOTE: L&#39;échantillon est prêt à être utilisé et peut être conservé à -20 ° C. </li></ol> 2. étalonnage et le fonctionnement des pinces optiques <ol><li> Calibrer Pixel Taille de moniteur vidéo <ol><li> Utilisez le piège optique pour piéger un cordon de diamètre connu (de taille standard). </li><li> Capture d&#39;images d&#39;un cordon piégé en utilisant un logiciel d&#39;imagerie (figure 4). </li><li> Déterminer le diamètre de la bille à l&#39;aide du logiciel de formation d&#39;image sur la base de la méthode centroïde. </li><li> Répétez cette procédure pour déterminer le diamètre de perles de différentes tailles. </li><li> Monter les diamètres mesurés et connus des billes par une régression linéaire pour obtenir la taille physique d&#39;un pixel. </li></ol></li><li> Vérifiez Calibration de distance <ol><li> Utilisez le piège optique pour piéger un cordon. </li><li> Déterminer la position de pixel de son centre de gravité par le logiciel de capture d&#39;image et enregistrer sa position en utilisant les Minitweezers. </li><li> Dirigez le bourrelet à DIFFE<html> louer positions et répéter la détermination de la position. </li><li> Autre les positions X et Y de la bille à partir de pixels à l&#39;unité de m en utilisant la taille de pixel calibré. </li><li> Comparer les X et Y entre les positions mesurées par vidéo et par les Minitweezers. Les deux ensembles de valeurs devraient convenir. Comme la résolution de l&#39;image est&gt; 0,1 um, déplacer le bourrelet par-dessus 1 um entre les mesures pour assurer l&#39;exactitude. Si l&#39;étalonnage à distance n&#39;est pas comparable à celui enregistré dans les Minitweezers, réglage de l&#39;instrument. </li></ol></li><li> Piège rigidité étalonnage <ol><li> Capturez un cordon à l&#39;aide du piège optique et maintenez-le encore. </li><li> Enregistrer la force de la machine en utilisant une acquisition rapide de données de dérivation à un taux&gt; 5 kHz pendant 3 sec. </li><li> Générer un spectre de puissance à partir de l&#39;enregistrement du mouvement des billes en utilisant un logiciel. Monter le spectre de puissance à une lorentzienne (Figure 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Eq. 1) où S (f) est la puissance à la fréquence de f, f c est la fréquence de coupure, et S 0 est la puissance asymptotique. La fréquence de coupure f c est la fréquence à laquelle la puissance de l&#39;agitation thermique a diminué à la moitié de la valeur asymptotique. Comme f c varie avec la puissance du laser et la taille des billes, calibrer chaque bille piégée individuellement. </li><li> Calculer la constante du ressort du piège, κ, de f c: <img alt="Equation 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Équation 2.) où γ est le coefficient de traînée du bourrelet (Eq. 3). Utilisez la constante de rappel pour déterminer les changements d&#39;extension d&#39;un ARN de changement de force. </li></ol></li><li> Droit d&#39;essai de Stokes <ol><li> Capturez un cordon à l&#39;aide du piège optique. Déplacez la bille va-et-vigueur à des vitesses différentes. </li><li> Enregistrer le mouvement de la bille et le forcer à l&#39;aide des Minitweezers. </li><li> Calculer le rayon de la bille. NOTE: La force de frottement, F d, généré par le mouvement d&#39;une particule sphérique dans un fluide peut être décrit par la loi de Stokes: <img alt="Équation 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Équation 3.) dans laquelle r est le rayon de la sphère, v est la vitesse, et h est la viscosité dynamique du fluide, qui peut être trouvée dans les tables de référence. Utilisation de la force F mesurée comme d, le rayon de la bille peut être calculée en utilisant l&#39;équation. 3 (Figure 6) et doit concorder avec celle déterminée par le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. Le test de la loi de Stokes teste efficacement les étalonnages et les performances de l&#39;instrument global. </li></ol></li></ol> 3. Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple <ol><li> Faire fluidique. <ol><li> Percez six trous (mm de diamètre 2 chacun) sur un couvercle de verre n ° 2 (figure 7a) et couper trois fentes (largeur 2 mm) dans du ruban adhésif double-face polyimide (figure 7b) à l&#39;aide d&#39;un graveur laser. </li><li> Faire une chambre d&#39;écoulement en prenant en sandwich deux couvercle en verre avec deux couches de ruban adhésif double face Kapton. Insérez une micropipette et deux tubes de dérivation entre la bande (figure 7c). </li><li> Montez la chambre de flux sur un cadre métallique en faisant correspondre les trous fluidiques (figure 7d). </li><li> Connectez les canaux fluidiques de la chambre à 10 ml seringues remplies avec le tampon de choix par les tuyaux de polyéthylène (figure 7e). </li><li> Montez la totalité de la chambre sur les pinces optiques entre les deux objectifs. Assurez-vous que la face avant de la chambre avec les canaux fluidiques face à la droite. Rétracter le droit objectif et branchez les broches en laiton du cadre (figure 7e) à trous de montage sur til pincettes. Serrez les vis pour fixer la position de la chambre. </li></ol></li><li> Mélanger l&#39;échantillon et perles recuit. Mélanger l&#39;échantillon recuit avec des perles anti-digoxigénine-enduits (DIG-perles), et laissez le mélange de rester à la température ambiante pendant 5-10 min. Typiquement, 1 ul de l&#39;échantillon recuit est mélangé avec 5 ul DIG-billes dans 1 ml de tampon. REMARQUE: La quantité de billes à être chargée dans la chambre d&#39;écoulement doit être choisi pour assurer une quantité suffisante de billes à être délivré à partir du tube de dérivation. Le rapport entre l&#39;échantillon recuit à billes ne peut pas être facilement quantifiée. Dans un cas idéal, la plupart des billes n&#39;ont pas d&#39;ARN de telle sorte que seule une petite fraction de billes peut avoir seulement une molécule d&#39;ARN par bille. Comme les échantillons recuits et la suspension de billes sont difficiles à quantifier, et la meilleure manière actuellement est seulement de faire varier le rapport de mélange et le mélange tester sur la pince à épiler. </li><li> Fournir des billes vers le site de réaction dans la chambre d&#39;écoulement (par exemple, de quelques micromètres au-dessus de la mipointe de cropipette, figure 7c). <ol><li> Chargez une suspension de billes revêtues de streptavidine (streptocoque-billes) dans une seringue de 1 ml. </li><li> Raccorder la seringue au tube de fluide conduisant à la voie inférieure de la chambre d&#39;écoulement (figure 7a). </li><li> Poussez la seringue à couler les streptocoques-billes dans la chambre. </li><li> Déplacer l&#39;ensemble de la chambre en utilisant un logiciel de commande des moteurs afin de placer le piège optique à proximité de l&#39;ouverture du tube de dérivation inférieur (Figure 7b). Actionnez ensuite le piège optique par un trackball pour capturer une angine de billes. </li><li> Déplacer la bille à proximité de la pointe de la micropipette à l&#39;aide du logiciel de commande du moteur. </li><li> Tirer la seringue reliée à la micropipette à sucer la perle sur la micropipette. </li><li> Appliquer flux doucement en appuyant sur la seringue pour le canal central pour débusquer streptocoque-perles supplémentaires. </li><li> De même, fournir le mélange de l&#39;échantillon et les fouilles-perles (voir l&#39;étape 3.2) à la chaîne haut de la chambre. </li><li> Capturer une fouille-perle et l&#39;amener près de la strep perle utilisant le piège optique. </li><li> Nettoyer le canal du milieu en appliquant flux. NOTE: La streptomycine et Dig-perles sont choisis pour être de tailles différentes afin qu&#39;ils puissent être distingués visuellement sous la vue microscopique (Figure 4). </li></ol></li><li> Pêche &quot;une seule molécule d&#39;attacher entre une paire de talons. <ol><li> Placez le dig-perle verticalement au-dessus de l&#39;angine de billes (figure 4). </li><li> Déplacez le dig-talon descendant vers le streptocoque de billes en orientant le piège. Ouvrez une fenêtre de tracé vigueur distance sur l&#39;ordinateur pour visualiser les changements de force. </li><li> Au contact des deux perles, déplacez le dig-perle verticalement loin de l&#39;angine de billes. </li><li> Si aucun contact spécifique est faite, la force reste presque nulle. Si les deux bourrelets sont reliés par des molécules, la force augmente de façon significative lorsque les deux billes se séparent. Ce procédé, communément appelé &quot;pêche&quot;, est souvent perfORMED plusieurs fois sur chaque paire de talons pour trouver une attache seule molécule efficace. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

<html> Modification et dépannage dans la préparation des échantillons à la pince Choix du vecteur de clonage. Bien que le schéma général décrit ici (figure 3) ne nécessite pas un vecteur de clonage particulier, le vecteur est préférable de ne pas avoir intrinsèque T7 ou le promoteur T3 pour la facilité de la transcription tel qu&#39;un promoteur peut être introduit par PCR dans des positions souhaitées. <em...

Le développement de la technique des pinces optiques, a longtemps été accompagné de son application dans la recherche biologique. Lorsque l&#39;effet de piégeage optique a été découvert, Arthur Ashkin observé que les bactéries dans l&#39;eau contaminée pourraient être piégés au foyer laser 1. Depuis lors, les bactéries de piégeage est devenu, une expérience amusante involontaire pour des générations d&#39;étudiants de biophysique ainsi que d&#39;un outil de recherche sérieuse pour étudier la physiologie microbienne 2,3. La technique de piégeage optique utilise faisceau laser focalisé à immobiliser un objet microscopique 1. En pratique, le fonctionnement d&#39;un piège à laser comme un ressort optique, qui mesure également la force (F) sur l&#39;objet emprisonné par son déplacement à partir du centre du piège (AX). Dans un court intervalle, F = κ x AX, dans κ est la constante du ressort du piège. Le piège optique peut être utilisé pour exercer une force dans picoNewton (PN) de précision à un microsobjet endoscopique et de mesurer sa position nanomètre (nm) exactitude. Dans les deux dernières décennies, les pinces optiques sont devenus l&#39;une des techniques unique de molécules les plus utilisées en biophysique. La technique a été utilisée pour étudier le pliage et la mécanique de l&#39;ADN 4-6, 7-9 ARN, protéines et 10,11. Pinces optiques ont également été utilisés pour observer la replication de l&#39;ADN 12, 13 transcription de l&#39;ARN, et la synthèse des protéines 14,15, ainsi que de nombreux autres événements biomoléculaires 16-18. Approches molécule unique sont utilisés dans la recherche de l&#39;ARN structurel principalement à explorer le robuste paysage énergétique de pliage de l&#39;ARN. Une séquence d&#39;ARN peut souvent se replier en plusieurs structures stables et mutuellement exclusifs, en raison des règles simples de composition chimique et à éplucher de base d&#39;ARN. Il est connu depuis longtemps que l&#39;ARN polymorphisme structural, comme cela se produit dans riboswitchs 19,20, joue un rôle important dans la régulation des gènes. A en Eurt sondage de l&#39;ensemble du génome a révélé que les variations de température d&#39;à peine quelques degrés influencent grandement la structure et la synthèse des protéines d&#39;une grande partie du transcriptome cellulaire 21. Cet exemple laisse entendre que le rôle biologique de remplacement pliage de l&#39;ARN est peut-être plus importante et omniprésente que prévu précédemment. Polymorphisme structural, pose cependant un défi pour les approches biochimiques et biophysiques traditionnelles, qui examinent les propriétés moyennes de nombreuses molécules. Par exemple, la &quot;marche&quot; et conformations &quot;off&quot; d&#39;un riboswitch sont mutuellement exclusifs. Une structure moyenne dérivée de structures hétérogènes n&#39;est pas susceptible de ressembler à l&#39;une des conformations biologiquement pertinentes. En outre, l&#39;ARN non traduite de l&#39;ARNm et forment généralement des structures. Leur interaction avec les protéines et les ARN régulateurs nécessite souvent déroulement de la structure existante dans le cadre de l&#39;interaction. Par conséquent, l&#39;étude de l&#39;ARN dépliage / repliage devient pertinentequestion de l&#39;ARN biologie. Pour répondre à un tel défi, l&#39;approche unique molécule a été utilisée pour démêler l&#39;ARN polymorphisme structural par l&#39;étude d&#39;une molécule à la fois 22-27. Par rapport à la méthode populaire de fluorescence de molécules uniques, pinces base mécanique déroulement offre un avantage que les conformations de molécules individuelles peuvent être manipulés par la force appliquée et être mesurées avec une précision nanométrique. Cette capacité de nanomanipulation peut être utilisé pour surveiller le déploiement / repliement des domaines structuraux individuels tels que le pliage d&#39;un grand hiérarchique ARN peut être 28 disséqué. En variante, un seul brin peut être dirigé pour se plier dans une de plusieurs conformères; ou une structure existante peut être induite mécaniquement à se replier en une conformation différente 29. Dans les conditions biologiques, une structure d&#39;ARN peut être modifié lors d&#39;un changement de température ou la liaison du ligand. La capacité de manipulation directement s moléculairestructure ouvre un nouveau lieu d&#39;ARN étude structurale. En principe, d&#39;autres techniques mécaniques, telles que la microscopie à force atomique et des pinces magnétiques, peuvent également être utilisées pour étudier le pliage de molécules d&#39;ARN simple. Cependant, ces applications sont limitées en grande partie en raison de la relativement faible résolution spatiale 30. L&#39;emploi de pinces optiques permet structures d&#39;ARN à être déployés par la force mécanique. L&#39;avantage de mécanique déroulement est plusieurs fois. La force peut être utilisée pour déployer la fois des structures secondaires et tertiaires, alors que les ions métalliques et ligand induit pliage se limitent principalement à des structures tertiaires. Température et dénaturant peuvent affecter de manière significative les activités de l&#39;eau et de solutés. En revanche, force est appliquée localement pour perturber des structures moléculaires; l&#39;effet de la force sur l&#39;environnement est négligeable. En outre, la fusion thermique est le mieux d&#39;étudier la thermodynamique de pliage de petites structures d&#39;ARN,tandis que les pinces optiques ont été utilisées pour étudier les structures d&#39;ARN avec différentes tailles, allant de un à sept paires de bases tétraboucle épingle à cheveux 28 à un ribozyme 31 400 nucleotides. En outre, les structures d&#39;ARN peuvent être dépliés mécaniquement à des températures mésophiles. En revanche, les ARN de se dérouler dans une expérience de fusion thermique, la température est généralement élevée bien au-dessus des températures physiologiques, ce qui augmente considérablement l&#39;hydrolyse de l&#39;ARN, en particulier en présence d&#39;ions Mg 2 +. Il est important de noter que l&#39;effet mécanique de la force dépend de la façon dont elle est appliquée sur une structure. La force appliquée bascule le paysage énergétique de pliage. Par exemple, lorsqu&#39;une force est appliquée sur une épingle à cheveux, les paires de bases sont brisées de façon séquentielle, un à la fois (figure 1a). La fourche de déchirure progresse en hélice le long de l&#39;axe, qui est perpendiculaire à la force appliquée. En revanche, quand un complexe kissing minimal est sous tension, les deux n&#39;embrassepaires de bases, qui sont parallèles à la force appliquée, la part de la force de charge (figure 1b). Les différentes géométries de l&#39;épingle à cheveux et embrassant complexe par rapport au résultat de la force appliquée à la réponse mécanique différente, qui peut être utilisé pour distinguer pliage secondaire et tertiaire 28,32. L&#39;aspect théorique de la mécanique qui se déroule a déjà été examinée 8,9,30. Ce travail décrit les approches de base pour mettre en place et exécuter un test déroulement mécanique seule molécule. Configuration expérimentale. Dans notre expérience de traction mécanique, l&#39;échantillon d&#39;ARN est constituée de pinçage de l&#39;ARN d&#39;intérêt flanquée par deux poignées doubles brins d&#39;ADN / ARN (figure 2) 7. L&#39;ensemble de la molécule peut être attaché à deux bourrelets micron de taille à revêtement de surface (Spherotech) via la streptavidine-biotine et les interactions anticorps anti-digoxigénine-digoxigénine, respectivement. Une bille est maintenue par un tr optique de mesure de forceap, tandis que l&#39;autre se tient sur la pointe d&#39;une micropipette. La distance relative entre les billes peut être modifiée soit par le piège de direction ou de déplacement de la micropipette. En utilisant cette approche, une molécule d&#39;ARN simple attacher les billes peut être étiré et relâché. Préparation des échantillons. La synthèse des échantillons d&#39;ARN pour épilation comprend plusieurs étapes (Figure 3). Tout d&#39;abord, la séquence d&#39;ADN correspondant à l&#39;ARN d&#39;intérêt est d&#39;abord clone dans un vecteur plasmidique. Ensuite, trois réactions de PCR sont réalisées pour produire les deux poignées et une matrice pour la transcription. Le modèle de transcription comprend les régions de la poignée et les séquences insérées. L&#39;ARN de pleine longueur est synthétisé par transcription in vitro. Enfin, l&#39;ARN et les poignées modifiés chimiquement sont recuites ensemble pour produire les molécules pour l&#39;épilation. Calibrage et le fonctionnement des pincettes. La conception de base de l&#39;utilisation Minitweezersd dans ce travail suit celle des double faisceau pinces optiques 33. Avec de nombreuses améliorations, les Minitweezers affichent une stabilité extraordinaire par rapport aux pinces optiques de première génération. Un certain nombre de groupes de recherche dans plusieurs pays utilisent les Minitweezers dans leur recherche de molécule unique 14,15,34-37. Les détails de la construction, de l&#39;étalonnage et le fonctionnement de l&#39;appareil, y compris des vidéos d&#39;instruction, sont disponibles sur le site Web &quot;pincettes Lab&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). Ici, des améliorations et des procédures d&#39;étalonnage qui doivent être effectuées sur des bases quotidiennes sont décrites en détail.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

Une grande partie du génome humain est transcrit mais non traduit. Dans cette ère de la génomique de poste, les fonctions de réglementation de l&#39;ARN a été démontré que de plus en plus importante. En fonction de l&#39;ARN est souvent fonction de sa capacité à adopter des structures alternatives, il est difficile de prédire l&#39;ARN structures tridimensionnelles directement à partir de la séquence. Seule molécule approches montrent potentiels pour résoudre le problème de l&#39;ARN polymorphisme structural par le suivi des structures moléculaires d&#39;une molécule à la fois. Ce produit présente une méthode pour manipuler précisément le pliage et la structure de molécules d&#39;ARN simple à l&#39;aide de pinces optiques. Tout d&#39;abord, les méthodes pour synthétiser des molécules convenant à une seule molécule travail mécanique sont décrits. , Diverses procédures d&#39;étalonnage Suivant pour assurer les opérations propres des pinces optiques sont discutées. Ensuite, diverses expériences sont expliquées. Pour démontrer l&#39;utilité de la technique, les résultats d&#39;déroulent mécaniquement épingles à cheveux d&#39;ARN et un ARN simple Kissincomplexe de g sont utilisés comme éléments de preuve. Dans ces exemples, la technique de nano-manipulation a été utilisé pour étudier le pliage de chaque domaine structural, secondaire et tertiaire, y compris, de façon indépendante. Enfin, les limitations et les futures applications du procédé sont discutées.

Limité par l&#39;espace, nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple est attesté par des seuls exemples qui se déroulent mécaniques des épingles à cheveux d&#39;ARN et un ARN avec une structure tertiaire. Manipuler simple épingle à cheveux molécules Une fois qu&#39;une attache est établie entre les billes, et l&#39;extension de la force sur l&#39;attache peuvent être manipulées en utilisant un protocole défini par l&#39;utilisate...

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Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K vues.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

Vidéo: Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

S&#39;étendant de courtes séquences d&#39;ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Recherche

Bio-ingénierie

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

En synthèse in vitro de la maternelle, de l&#39;espacement de longue fibreux et segmentaire collagène Espacement long

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...