Fret à molécule unique peut capturer la dynamique qui se produit à des distances nanométriques, ce qui est la bonne échelle pour le processus de biosynthèse des protéines ribosomiques. Le ribosome agit en coordonnant de multiples facteurs et composants de manière allostérique, ce qui est intrinsèquement inhomogène. La méthode à molécule unique peut suivre chaque ribosome sans être limitée par cet effet moyen inhomogène.
Cette méthode révélera comment les antibiotiques inhibent la fonction des ribosomes pour développer de nouveaux médicaments contre les infections bactériennes résistantes aux médicaments. Commencez par préparer le PRE en mélangeant le mélange d’initiation EFTU, NOG et PAG dans un rapport de un à deux pour deux à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Après l’incubation, purifier le PRE à l’aide d’une ultracentrifugation de coussin de saccharose molaire 1,1 pendant la nuit à 100 000 fois G.Préparez le POST en mélangeant le mélange d’initiation EFTU, WG et PHE dans un rapport de un à deux à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après l’incubation, purifiez le POST à l’aide d’une ultracentrifugation de coussin de saccharose molaire 1,1 pendant la nuit à 100 000 fois G.Nettoyez les lames de verre du microscope contenant six paires de trous d’un millimètre de diamètre et les couvercles en verre de microscope numéro 1.5. Cuire les lames et les couvercles propres à 300 degrés Celsius pendant trois heures, puis enduire le couvercle avec de l’aminosaline. Dans une hotte laminaire propre, posez un couvercle à plat sur la surface.
Laissez tomber soigneusement 60 microlitres de solution de PEG sur le bord supérieur, puis posez un autre couvercle sur le dessus, en laissant l’effet capillaire répartir la solution entre eux en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme. Répétez ces étapes pour deux autres paires de couvercles. Conservez ces couvercles dans une boîte à embouts vide remplie d’eau et incuubez-les pendant trois heures dans l’obscurité.
Après trois heures, séparez les couvercles, rincez à l’eau dans trois creusets consécutifs et purgez avec un jet d’azote sec. Tirez les pointes de pipette tranchantes à travers les trous des glissières en verre jusqu’à ce qu’elles s’ajustent bien. Grattez les extrémités tranchantes jusqu’à ce qu’elles soient complètement plates avec la surface en verre, puis coupez un ruban adhésif à double face avec le motif de canal dessus.
Collez le sur les glissières de verre sur le côté plat. Collez le couvercle enduit sur le ruban adhésif double face et appuyez dessus pour sceller hermétiquement la chambre d’échantillonnage, en vous assurant que le côté enduit est tourné vers l’intérieur. Allumez l’ordinateur et le commutateur de microscope.
Démarrez l’interface de contrôle laser et allumez le laser. Appuyez sur le bouton d’activation du boîtier de commande laser pour réchauffer le laser. Allumez les caméras, puis démarrez le logiciel associé au microscope.
Cliquez sur l’obturateur supérieur et cliquez sur la lampe allumée. Préparez le TAM10 avec un tampon Tween en ajoutant 10 microlitres de 5% Tween-20 dans un millilitre de tampon TAM10. Préparez la solution de désoxy en pesant trois milligrammes de glucose oxydase dans un petit tube de microcentrifugation et ajoutez-y 45 microlitres de catalase.
Vortex le tube doucement pour dissoudre le solide. Tourner à 20 000 fois G dans une microcentrifugeuse pendant une minute et prendre le surnageant. Préparez une solution de glucose à 30%, une solution de Trolox de 200 millimolaires et 0,5 milligramme par millilitre de solution de streptavidine en suivant les instructions du manuscrit textuel.
Ajoutez une goutte d’huile d’imagerie à l’objectif du gazon. Mettez les chambres d’échantillonnage sur l’objectif. Remplissez la chambre avec 10 microlitres de solution de streptavidine et attendez une minute.
Lavez la chambre avec 30 microlitres de TAM10 avec tampon Tween, en collectant la solution de passage avec un papier filtre plié. Attendez une minute après le lavage. Diluer les complexes ribosomes PRE ou POST à des concentrations nanomolaires de 10 à 15 avec TAM10 avec tampon Tween.
Chargez 20 microlitres de l’échantillon de ribosome dans le canal et attendez deux minutes. Fabriquez le tampon d’imagerie en utilisant 50 microlitres de tampon TAM10 et 0,5 microlitres de solution de désoxyglucose et de Trolox. Mélangez-les bien.
Rincez la chambre avec 30 millilitres de tampon d’imagerie. Réglez l’appareil photo pour l’acquisition d’images. Cliquez sur l’obturateur supérieur et éteignez la lampe.
Démarrez l’acquisition de la caméra et répartissez les images dans trois fenêtres représentant deux caméras individuelles et la superposition. Dans le menu Acquérir, sélectionnez capture timelapse, puis cliquez sur capturer automatiquement. Définissez le nom de fichier approprié, le chemin d’accès au fichier et le nombre de boucles et cliquez sur Exécuter maintenant.
Fermez la fenêtre contextuelle une fois l’acquisition de l’image terminée, puis ouvrez le fichier ND acquis. Cliquez sur ROI, éditeur de ROI simple et choisissez le cercle d’options. Sélectionnez le retour sur investissement sur l’image et cliquez sur terminer lorsqu’elle est terminée.
Cliquez sur mesure, mesure du temps pour afficher les données sous forme de graphique ou de feuille de calcul. Ouvrez l’onglet d’exportation pour définir les paramètres d’exportation, puis cliquez sur exporter pour enregistrer les intensités. Enfin, ouvrez le fichier qui a été exporté à l’aide d’une application appropriée.
La distance entre le résidu de étiquetage L27 et l’ARNt du site A ou du site P est respectivement de 61 ou 52 angströms, ce qui correspond à une efficacité FRET de 0,47 et 0,65. Les intensités de florescence des canaux donneur et accepteur ont été récupérées et tracées sous forme de timelapses. Après le blanchiment du donneur, les deux traces se sont approchées de la ligne de base car aucune excitation ne pouvait se produire directement sur l’accepteur.
Après le blanchiment de l’accepteur, l’intensité du donneur a augmenté car moins de voies de réaction dissipaient l’énergie d’excitation. Les ribosomes individuels présentaient des fluctuations différentes en raison du mouvement oscillant des ARNt, ce qui provoquait des fluctuations de distance au L27. D’autres méthodes telles que le test de puromycine, le test d’impression des orteils et les spécifications de masse sont complémentaires à la méthode FRET à molécule unique et révèlent plus de détails sur la synthèse des protéines.
Fret mono-molécule a une large application parce que de nombreux processus biologiques se produisent dans la gamme nanométrique et à des échelles de temps millisecondes. En marquant les colorants appropriés à des positions appropriées, de nombreuses autres dynamiques peuvent être révélées.
