Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur le rôle direct du tau dans le compartiment nucléaire tout en excluant toute contamination potentielle par le tau cytoplasmique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est largement applicable à l’étude sur la fonction nucléaire du tau dans d’autres types de cellules et dans différentes conditions cellulaires. Giacomo Siano, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par placage quatre fois 10 aux cinq cellules de la lignée cellulaire du neuroblastome humain SH-SY5Y à transfecter avec le vecteur de contrôle vide, quatre fois 10 aux cinq cellules à transfecter avec tau non étiqueté, quatre fois 10 aux cinq cellules à transfecter avec tau-NLS, et quatre fois 10 aux cinq cellules à transfecter avec tau-NES dans les puits individuels d’une plaque de six puits. Le lendemain du placage, incuber séparément 400 nanogrammes d’ADN et le volume approprié de lipides cationiques dans un tube de 250 microlitres de sérum réduit par puits. Après cinq minutes à température ambiante, combiner chaque vecteur avec un volume de lipides cationiques et incuber les complexes lipidiques de l’ADN pendant 20 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants dans chaque puits par deux millilitres de culture complète fraîche moyenne et transfect chaque puits avec la solution complexe lipidique de l’ADN appropriée pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, remplacez les surnatants par un milieu de différenciation frais. Pour l’analyse occidentale de tache, lavez les cellules transfected et différenciées dans chaque puits avec PBS et incubez les cellules avec 500 microlitres de 0.1%Trypsin par puits pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.
Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec un volume égal de milieu complet et transférer la suspension cellulaire de chaque puits dans des tubes individuels pour centrifugation. Après avoir soigneusement enlevé les supernatants, resuspendez les granulés dans un millilitre de PBS par tube pour une deuxième centrifugation et retirez à nouveau les supernatants. Pour les extraits totaux de protéines, incuber les granulés pendant 30 minutes sur la glace en 50 à 100 microlitres de tampon de lyse complétés par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
À la fin de l’incubation, centrifuger l’extrait à 16 000 fois g pendant 15 minutes et quantifier la concentration en protéines par n’importe quel test de quantification standard. Mélangez ensuite 20 microgrammes de chaque échantillon de protéines avec cinq microlitres de tampon 4X Laemmli à un volume total de 20 microlitres et faites bouillir les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour la fractionnement subcellulaire, resuspendez les cellules dans le milieu complet pour compter et faites tourner vers le bas une fois 10 aux six cellules par échantillon.
Pour isoler la fraction cytosolique, incuber les granulés dans 100 microlitres de tampon d’extraction cytoplasmique glacé complété par des inhibiteurs de la protéase à quatre degrés Celsius avec un mélange doux pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, recueillir les échantillons par centrifugation et transférer les supernatants dans des tubes pré-réfrigérés. Ajouter 100 microlitres de tampon d’extraction de membrane glacée complétés par des inhibiteurs de protéase à la pastille pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius avec un mélange doux.
Ensuite, centrifugez les granulés pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 3000 fois g et recueillez les supernatants dans de nouveaux tubes. Pour recueillir la fraction nucléaire soluble, ajouter 50 microlitres de tampon d’extraction nucléaire complétés par des inhibiteurs de protéase aux granulés avec vortex avant d’incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, centrifuger les échantillons et recueillir les supernatants.
Pour recueillir la fraction nucléaire insoluble, ajouter 50 microlitres de tampon d’extraction nucléaire complétés par des inhibiteurs de la protéase, du chlorure de calcium et de la nucléase micrococcique aux granulés avec vortex. Incuber les échantillons pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avant le vortex et la centrifugeuse. Ensuite, recueillir les supernatants.
Pour recueillir la fraction cytosquelettique, ajouter 50 microlitres de tampon d’extraction cytosquelettique complétés par des inhibiteurs de protéase aux granulés avec vortex. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, centrifugez les échantillons et recueillez les supernatants. Pour l’analyse SDS-PAGE, ajouter sept microlitres de tampon 4X Laemmli à 20 microlitres de chacun des échantillons de fractions subcellulaires recueillis et faire bouillir les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.
À la fin de l’incubation, chargez les échantillons sur un gel d’acrylamide et effectuez l’électrophorèse à une tension constante de 120 volts. Transférer ensuite les protéines dans une membrane de nitrocellulose à 250 milliamps pendant 90 minutes. Incuber la membrane pendant cinq minutes dans ponceau solution de coloration pour vérifier l’électrophoresis gel protéique approprié et un ballonnement réussi.
À la fin de l’incubation, rincer la membrane à l’eau distillée jusqu’à ce que l’arrière-plan soit propre et enlever la tache avec un lavage continu avec de la solution saline tamponnée Tris complétée par de l’interpolation 20 pendant 10 minutes sur un shaker. Ensuite, incuber la membrane avec la solution de blocage pendant une heure à température ambiante en secouant avant de laver trois fois avec tris tamponné salin plus Tween 20 pendant cinq minutes par lavage. Après le dernier lavage, hybrider la membrane avec l’anticorps primaire d’intérêt dans le blocage de la solution pendant la nuit à quatre degrés Celsius suivie de trois lavages avec tris tamponné salin plus Tween 20 pendant cinq minutes.
Après le dernier lavage, hybrider la membrane avec un peroxyde de raifort approprié conjugué anticorps secondaires en bloquant la solution pendant une heure à température ambiante avant de laver la membrane avec tris tamponné saline plus Tween 20 trois fois pendant cinq minutes par lavage. Après le dernier lavage, détectez la bande protéique à l’aide de la chimioluminescence et quantifiez l’intensité des bandes de taches occidentales par ImageJ. En l’absence d’acide rétinoïque et de facteur neurotrophique dérivé du cerveau, les cellules SH-SY5Y indifférenciées supposent une morphologie plus ronde et forment des touffes cellulaires.
Comme prévu, après cinq jours de traitement à l’acide rétinoïque, les touffes se dénouent et les cellules s’étalent. Après trois jours additionnels de traitement avec le facteur neurotrophique cerveau-dérivé, les cellules apparaissent uniformément distribuées et interconnectées par l’intermédiaire d’un réseau de neurites rames. Après la transfection tau-NLS ou tau-NES, la localisation subcellulaire tau peut être détectée par immunofluorescence avec des anticorps anti-tau.
Selon l’efficacité de la transfection, les cellules affichent une forte coloration nucléaire fusionnant avec le signal DAPI après transfection tau-NLS ou une coloration cytoplasmique avec les noyaux vides après tau-NES. L’analyse occidentale de tache indique l’enrichissement de l’actine dans la fraction cytosquelettique, de la tubuline dans les fractions cytoplasmiques et cytosquelettiques, et du H2B dans les fractions nucléaires. L’analyse occidentale de tache confirme également l’expression du tau marqué et non marqué dans le compartiment nucléaire et du transporteur de glutamate vésiculaire une expression dans l’extrait total.
En effet, le rapport de tau dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques solubles met en évidence le fait que tau-NLS est fortement enrichi dans la fraction nucléaire soluble tandis que tau-NES est diminué. En outre, tau-NLS est enrichi dans la fraction chromatine-liée par rapport à la fraction cytoplasmique tandis que tau-NES est diminué. Assurez-vous de vérifier soigneusement le nombre de cellules utilisées pour la fractionnement de chaque échantillon et de vérifier l’enrichissement des gènes d’entretien ménager dans les fractions appropriées.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler les compartiments cellulaires et d’évaluer le rôle fonctionnel du tau dans le noyau.
