Un des mécanismes proposés par lesquels les anticorps thérapeutiques anti-Tau réduisent la pathologie dans la maladie d’Alzheimer est l’absorption dans le dégagement de l’ancien Tau agrégé pathologique par microglies. Ici, nous présentons l’analyse de base cellulaire pour évaluer l’absorption de Tau par microglies. Cet essai représente un outil d’investigation utile pour mieux caractériser le mécanisme d’action des anticorps anti-Tau.
Le premier jour de l’expérience, préparez les cellules BV-2 en les lavant d’abord avec 1x PBS dans le flacon dans lequel elles ont été cultivés. Puis les incuber avec 05% trypsine EDTA à 37 degrés Celsius et 5%C02 jusqu’à ce qu’ils se détachent de la fiole. Suspendre à nouveau les cellules dans le milieu de la culture en pipetage de haut en bas trois à cinq fois.
Comptez les cellules et préparez une suspension cellulaire avec une concentration finale de 100 000 cellules par millilitre dans un milieu de culture contenant 200 microgrammes par héparine millilitre. Ajouter 250 microlitres de cette suspension cellulaire par puits dans une plaque de fond plat de culture de tissu de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5%C02, du jour au lendemain.
Après avoir décongelé les agrégats de dye-Tau de pH préalablement préparés sur la glace, diluez-les en 65 microlitres par condition de milieu sans sérum, pour faire une solution nanomolaire de 500. Diluer les anticorps dans 65 microlitres de sérum moyen libre pour atteindre le double de la concentration désirée. Mélanger les agrégats de dye-Tau de pH et les anticorps dans une plaque de 96 puits en U- fond.
Sceller cette plaque de dilution et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, retirer le milieu de la plaque de puits 96 avec les cellules BV-2. Lavez les cellules dans chaque puits avec 100 microlitres de température ambiante 1x PBS.
Retirez le PBS de la plaque cellulaire BV-2. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 125 microlitres de complexes aminés de la plaque de dilution à chaque puits d’une plaque cellulaire BV-2 de 96 puits, et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Après l’incubation enlever les complexes aminés des cellules et laver les cellules dans chaque puits avec 100 microlitres de température ambiante 1x PBS.
Après avoir enlevé le 1x PBS ajouter 50 microlitres de 25%trypsine EDTA et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5%CO2. Après cela, ajouter 200 microlitres de milieu de culture et de suspendre à nouveau le puits par pipetting de haut en bas pour détacher les cellules. Transférer les cellules dans une plaque à fond U de 96 puits et la centrifuger à 400 x g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.
Déposer la plaque sur la glace et retirer le milieu. Ajouter 150 microlitres de glace froide 1x PBS et centrifugeuse à nouveau à 400 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Placez la plaque sur la glace et lavez-la à nouveau en enlevant 1x PBS précédemment ajouté et en ajoutant 150 microlitres de PBS glacé par puits.
Centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions. Placez la plaque sur la glace et lavez les cellules en enlevant le PBS précédemment ajouté et en ajoutant 150 microlitres tampon FACS par puits. Centrifugeuse à nouveau à 400 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.
Placez la plaque sur la glace et retirez le tampon FACS précédemment ajouté et suspendez les cellules en tampon FACS de 200 microlitres par puits. Procédez immédiatement à l’analyse par FACS pour acquérir 20 000 événements dans la porte de la cellule vivante. Pour l’analyse FACS, utilisez la zone de dispersion avant ou FSCA par rapport à la zone de dispersion latérale ou à la parcelle de densité SSCA pour se concentrer sur les cellules vivantes en excluant les événements ayant des niveaux de dispersion vers l’avant inférieurs, tels que les débris et les cellules mortes.
Ensuite, au sein de la population de cellules vivantes utiliser FSCA par rapport à la hauteur de dispersion vers l’avant ou FSCH pour créer une porte singlet et exclure les doublets cellulaires et les agrégats. Ensuite, utilisez les événements dans la porte singlet pour générer un colorant pH unique paramètre histogramme. Utilisez l’histogramme généré pour déterminer d’abord l’intensité moyenne de fluorescence.
Après cela déterminer le pourcentage de cellules positives de colorant de pH-Tau en excluant des cellules négatives comme déterminé utilisant le seul contrôle de BV-2. Les anticorps CBTau-28.1 favorisent une absorption de Tau dans les cellules BV-2 d’une manière dépendante de la dose, comme le montre la cytométrie du flux. L’anticorps double mutant CBTau-28.1 de haute affinité a 28.1 2 témenté l’absorption de Tau dans les cellules BV-2 dans une mesure plus élevée que l’anticorps sauvage de type.
Les fragments de Fab CBTau-28.1 n’ont pas augmenté l’absorption basale de Tau indiquant un mécanisme d’internalisation médié par récepteur de FC. La microscopie confoccale a confirmé l’augmentation médiatisée d’anticorps de l’absorption de Tau. Colorant vert de pH étiqueté tau agrégats souvent co-localisés avec lysotracker rouge colorant acides tachés suggérant ainsi la présence d’agrégats Tau dans un compartiment endolysosomal.
CBTau-28.1 Les fragments de Fab n’ont pas augmenté l’absorption de Tau à nouveau indiquant que l’absorption était en effet FC 2 médiatisée. L’analyse que nous venons de décrire nous permet de quantifier spécifiquement systématiquement l’absorption d’anticorps par tau par microglies. Les données générées avec cet essai peuvent aider à élucider le mécanisme d’action des anticorps anti-Tau représentant ainsi un outil utile pour faire progresser les anticorps anti-Tau pour aller plus loin dans leur développement en tant que traitement potentiel de la MA.
